国家自然科学基金(30800456)
- 作品数：3 被引量：4H指数：2
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- 相关机构：军事医学科学院华北煤炭医学院河北联合大学更多>>
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- 泛素C端水解酶L1的RNA干扰载体的构建及效果评价
- 2013年
- 目的:获得抑制效果好的泛素C端水解酶L1(UCH-L1)基因小干扰RNA(siRNA)干扰载体。方法:根据Gen Bank中大鼠UCH-L1基因序列设计并合成4对siRNA寡核苷酸序列,将4对寡核苷酸序列退火成双链后分别插入siRNA表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR中构建4个siRNA表达质粒,测序鉴定后将4个siRNA表达质粒分别转染HEK293细胞,利用Western印迹和qPCR方法检测干扰效果;将干扰效果最好的质粒包装成腺病毒,感染大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),并采用TNFα干预诱导UCH-L1表达升高,Western印迹验证干扰效果。结果:测序分析证实4对siRNA寡核苷酸序列分别插入siRNA表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR;qPCR检测与Western印迹均表明第3号siRNA表达载体对UCH-L1表达的抑制程度最高,将其包装成腺病毒并转染VSMC能显著抑制TNFα诱导的UCH-L1表达升高。结论:构建并筛选出干扰效果好的UCH-L1 siRNA干扰载体。
- 赵博刘晓华段梦张志清冷雪王立群武磊段瑞峰王广增张艳淑
- 关键词：RNA干扰HEK293细胞
- TNF-α诱导的血管平滑肌细胞迁移中UCH-L1蛋白表达水平变化被引量：2
- 2011年
- 目的研究UCH-L1在TNF-α诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)迁移过程中蛋白表达水平的变化规律,为探索UCH-L1在VSMC迁移中的作用提供依据。方法用组织块贴壁法体外培养大鼠VSMC,以改良的Boyden chamber方法和划痕法观察TNF-α对VSMC迁移的诱导作用;Western blot检测VSMC迁移过程中UCH-L1的蛋白表达水平变化。结果 Boyden chamber实验中,无TNF-α时细胞迁移数目约为(15.0±3.9)个,当TNF-α质量浓度为10 ng/ml时,细胞迁移数目达到最大,约(75.0±9.2)个(P<0.01),而以100 ng/ml TNF-α诱导时,细胞迁移数目降至(26.0±6.1)个。划痕实验中,随着TNF-α诱导时间的延长划痕间距变小,表明细胞迁移增加,约12 h始,划痕间距变小,有统计学意义(P<0.05);48 h时,细胞划痕间距接近至完全融合状态。在10ng/ml TNF-α诱导大鼠VSMC迁移过程中,诱导12 h时,UCH-L1蛋白表达水平开始明显升高(P<0.05),且随着诱导时间延长VSMC内UCH-L1蛋白表达水平呈逐渐升高的变化趋势。结论 TNF-α对大鼠VSMC迁移的诱导作用呈剂量和时间依赖关系,UCH-L1在TNF-α诱导的大鼠VSMC迁移过程中可起到调节作用。
- 段梦王立群战锐冷雪钱令嘉刘晓华
- 关键词：血管平滑肌细胞迁移TNF-Α
- 人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)表达及抗体制备被引量：2
- 2011年
- 目的重组表达及纯化人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(betaine-homocysteine methyltransferase,BHMT)蛋白,制备BHMT多克隆抗体并对其性质进行研究。方法 TRizol法提取人HepG2细胞总RNA,RT-PCR获得BHMT基因,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,构建重组表达载体pET-28a-BHMT,经0.5 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物通过Ni柱亲和纯化获得重组蛋白;以重组BHMT蛋白免疫兔,获得兔多克隆抗体,并对抗体进行纯化,应用Western印迹方法分析其识别人天然BHMT蛋白的能力。结果经测序证明,RT-PCR得到的人BHMT基因与Gen-Bank中人的BHMT基因完全一致;构建的BHMT原核表达载体可稳定地表达可溶性人BHMT蛋白;重组BHMT蛋白免疫兔后,兔血清抗体纯化获得高纯度BHMT抗体,此抗体可以特异性地识别人肝癌组织中的天然BHMT蛋白。结论成功重组表达并纯化人BHMT蛋白,所获得的BHMT多克隆抗体可以应用于人BHMT蛋白的检测,为研究BHMT在高同型半胱氨酸血症中的作用机制奠定基础。
- 冷雪王剑波杲修杰弓景波赵云武磊战锐王新兴刘晓华钱令嘉
- 关键词：克隆免疫印迹
