“十一五”国家科技支撑计划(2006BAD06A15)
- 作品数：9 被引量：16H指数：3
- 相关作者：舒跃龙谭文杰王敏阮力陈红更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心北京工业大学中国疾病预防控制中心病毒更多>>
- 发文基金：“十一五”国家科技支撑计划国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达被引量：2
- 2011年
- 目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(49～1 587 bp)、pMET A/NA(121～1 200 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了依据。
- 邹淑梅于在江张烨辛丽陈永坤陈禹保陈清轩舒跃龙
- 关键词：血凝素神经氨酸酶
- 含有人H5N1流感病毒NA基因的重组腺病毒候选疫苗株在小鼠体内诱发细胞免疫反应被引量：4
- 2009年
- 本研究旨在构建人H5N1流感病毒NA基因的重组腺病毒候选疫苗株,并考察其在BALB/c小鼠体内的细胞免疫效果。本研究选用流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)的NA基因为研究对象,分别将野生型和按照人密码子优化的NA基因插入重组腺病毒载体,构建并鉴定了两种重组腺病毒rAdV-WtNA和rAdV-Mod.NA,纯化后病毒在第0周和第4周以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠两次,免疫剂量是109TCID50/只/次,第5周时使用Elispot方法检测并比较病毒的细胞免疫效果。结果显示,所制备和纯化的两种重组病毒均可有效表达NA目的蛋白;免疫后的小鼠均可检测出明显的针对NA抗原的特异性细胞免疫反应,而且rAdV-Mod.NA组分泌IFN-γ细胞的数量显著高于rAdV-WtNA组(P=0.016)。说明rAdV-Mod.NA是较好的人H5N1流感病毒候选疫苗株,值得进一步深入研究。
- 马晶张晓光陈红李魁彪张晓梅张柯杨亮徐红舒跃龙谭文杰曾毅
- 关键词：H5N1神经氨酸酶重组腺病毒细胞免疫
- 表达人高致病性禽流感病毒H5N1(安徽株)结构基因的DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫应答分析被引量：4
- 2010年
- 本研究旨在研发经济、高效的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗并优化免疫方案。首先优化并合成H5N1(安徽株)的血凝素基因(HAop)和神经氨酸酶基因(NAop)并证实其正确表达,再构建含有H5N1(安徽株)结构基因的多个单顺反子(HAwt、HAop和NAop)和双顺反子(HAop/M2和NAop/M1)DNA疫苗质粒。随后,采用不同途径的体内电转法在第0周和第3周2次免疫Balb/C小鼠,初步分析了抗原特异性体液免疫(HA血凝抑制抗体,NA特异性抗体,中和抗体)和细胞免疫应答(IFN-γELISpot)的特点。结果表明:含有优化血凝素基因(HAop)和优化神经氨酸酶基因(NAop)的DNA疫苗可以快速激发较强的免疫应答,尤其是细胞免疫应答;皮内电转所激发的体液免疫应答强于肌肉电转。本研究为新型H5N1疫苗的研发以及免疫方案的优化奠定了基础。
- 王文陈红谭文杰邓瑶王敏刘源殷霄张柯管洁周剑芳舒跃龙阮力
- 关键词：H5N1DNA疫苗
- 含H5N1多个结构抗原的DNA疫苗与重组痘苗病毒疫苗联合免疫小鼠可明显增强免疫原性
- 2011年
- 本研究旨在研发经济、高效的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗并优化免疫方案。利用本实验室前期构建的含有H5N1(安徽株)结构基因的多个单顺反子(HAop和NAop)和双顺反子(HAop/M2和NAop/M1)DNA疫苗及重组痘苗病毒(天坛株)疫苗,采用不同方案(单独或联合)免疫BALB/c小鼠,初步分析了抗原特异性体液免疫(HA血凝抑制抗体,NA特异性抗体,中和抗体及M1与M2特异性抗体)和细胞免疫应答(IFN-γELIS-pot)的特点。结果表明:DNA疫苗与重组痘苗病毒(天坛株)疫苗联合免疫可以激发较强的多个抗原特异的免疫应答,尤其是体液免疫应答,明显优于DNA疫苗或重组痘苗病毒(天坛株)疫苗单独免疫;联合免疫方案中DNA疫苗初免所激发的HA与NA特异的体液免疫应答强于重组痘苗病毒(天坛株)疫苗初免,然而M1与M2特异的体液免疫应答则反之。本研究为新型H5N1疫苗的研发及免疫方案的优化奠定了基础。
- 王文陈红邓瑶杨扬殷霄王敏周剑芳舒跃龙阮力谭文杰
- 关键词：H5N1DNA疫苗联合免疫
- 含有H5N1 NA基因重组腺病毒疫苗在小鼠体内的免疫效果研究被引量：1
- 2009年
- 目的考察含有禽流感病毒A／Anhui／1／2005（H5N1）优化型NA基因的重组腺病毒在BALB／c小鼠体内的免疫效果，并筛选合适的免疫剂量。方法重组病毒以肌内注射方式在第0周和第4周免疫BALB／c小鼠两次，低、中、高组的免疫剂量分别是10^5、10^7和10^9 TCID50/次，第5周时分别使用神经氨酸酶活性抑制试验和ELISpot实验来检测和比较疫苗的体液和细胞免疫效果。结果重组病毒免疫后的小鼠均可检测出针对NA抗原的特异性体液和细胞免疫反应，并且免疫效果与免疫剂量呈正相关，10^7 TCID50／只／次是合适的免疫剂量。另外，从包含NA全长氨基酸残基的合成肽库中筛选到两个能够刺激BALB／c小鼠T淋巴细胞分泌IFN-γ的表位，即NA109-124：CRTFFLTQGALLNDKH和NA182-199：AVAVLKYNGIITDTIKSW。结论含有优化型NA基因的重组腺病毒疫苗能够诱导BALB／c小鼠同时产生NA抗原特异性的体液和细胞免疫反应，是较好的H5N1流感病毒候选疫苗株，值得进一步深入研究。
- 马晶张晓光李魁彪张晓梅王敏白天杨亮徐红舒跃龙曾毅
- 关键词：神经氨酸酶腺病毒免疫
- 人高致病性禽流感病毒H5N1安徽株HA、M2蛋白双顺反子表达载体的构建及表达研究被引量：5
- 2008年
- 将我国分离的人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和M2基因片段并克隆至DNA疫苗表达载体pVRC中,构建成真核表达质粒。为提高HA的表达量,按照人偏爱密码子将HA基因进行优化改造,经全基因合成后插入真核表达载体pVRC,以β-actin蛋白为内参比证明了优化后的HA蛋白表达效果明显提高。将M2基因和优化后的HA基因共同克隆入双顺反子表达载体pIRES中,获得同时表达HA或M2的双顺反子真核表达质粒;通过Western blot和间接免疫荧光检测方法,确认构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和M2。通过上述结果为进一步开展人高致病性禽流感病毒安徽株HA和M2基因的功能与致病性研究及使用表达HA和M2蛋白进行新型人用禽流感双价疫苗研发奠定基础。
- 刘源张柯谭文杰王慧娟舒跃龙胡桂学阮力
- 关键词：H5N1HAM2
- 禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达
- 2010年
- 目的:克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuram idinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法:在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(49～1587bp)、pET32a(+)/NA(121～1141bp)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTraP4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果:重组蛋白在大肠杆菌中可以高效达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白纯度占总蛋白的90%以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。
- 邹淑梅于在江张烨辛丽陈永坤唐启慧陈禹保陈清轩舒跃龙
- 关键词：血凝素神经氨酸酶克隆表达
- 人禽流感病毒H5N1多价重组痘苗病毒（天坛株）疫苗在小鼠中的免疫原性研究被引量：3
- 2010年
- 目的 研发高效广谱的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗.方法 首先构建了含H5N1（安徽株）结构基因[血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白M1与M2]的两个双顺反子（HAop/M2,NAop/M1）重组痘苗病毒（rTTV天坛株）疫苗,采用不同剂量（104 PFU或107PFU）或组合（疫苗单独或联合）方式于0、4周二次免疫BALB/c小鼠,初步比较分析抗原特异的体液（HA血凝抑制抗体、NA特异性抗体、中和抗体）与细胞免疫应答（IFN-γ ELISPOT）特点.结果 重组痘苗病毒疫苗可有效表达H5N1靶抗原;高剂量组的重组痘苗病毒疫苗可快速激发较强的针对各个抗原的抗体与针对血凝素与神经氨酸酶蛋白的细胞免疫应答,含血凝素蛋白的重组痘苗病毒疫苗亦可诱导明显的中和抗体;但各组重组痘苗病毒疫苗所激发的针对基质蛋白（M1,M2）的细胞免疫应答均较弱;两个双顺反子（HAop/M2,NAop/M1）重组痘苗病毒疫苗联合应用所激发的针对基质蛋白2（M2）的体液免疫应答明显强于单双顺反子（HAop/M2）疫苗单独应用.结论 本研究中制备的各组重组痘苗病毒疫苗可诱导多个抗原特异的体液与细胞免疫应答,该研究为新型H5N1疫苗的研发及免疫方案的优化奠定了基础.
- 王文邓瑶谭文杰陈红王敏殷霄管洁周剑芳舒跃龙阮力
- 关键词：H5N1
- 密码子优化的人H5N1流感病毒HA基因在哺乳动物细胞中获得高效表达被引量：2
- 2008年
- 为了提高人禽流感病毒血凝素HA的表达量,应对流感大流行疫苗的需求,按照人的偏爱密码子将H5N1(A/Anhui/1/2005)流感病毒的HA基因进行优化改造,经全基因合成后插入到真核表达载体pDC315中,构建了真核表达质粒pDC315-Mod·HA;将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pDC315-Wt·HA分别转染293T细胞,比较HA蛋白的表达量。结果表明:经间接免疫荧光实验及Western blot实验比较和鉴定,密码子优化后,HA蛋白在293T细胞中的表达水平显著提高,为流感大流行疫苗的研究打下了基础。
- 李魁彪张晓光马晶贾晓俊王敏董婕张晓梅徐红舒跃龙
- 关键词：H5N1HA密码子优化真核表达
