浙江省自然科学基金(Y2090468)
- 作品数：8 被引量：11H指数：2
- 相关作者：楼永良谢旦立陈建林刘艳飞许玲更多>>
- 相关机构：温州医学院浙江大学教育部更多>>
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- 创伤弧菌溶细胞素蓖麻毒素B活性模序的预测、克隆表达和功能鉴定被引量：3
- 2013年
- 目的研究克隆表达的创伤弧菌溶细胞素（VVC）中的重组蓖麻毒素B（rRicinB）功能模序，明确其功能，进一步阐明创伤弧菌溶细胞素的分子致病机制。方法生物信息学预测VVC中的功能模序，构建pET28a-rRicinB原核表达系统，并通过IPTG诱导表达、三步洗涤、Ni24NTA柱亲和层析法纯化、复性、ELISA检测和激光共聚焦显微镜检测FITC标记的rRicinB与Hela细胞相互作用等。结果通过生物信息学预测到YVC中336～465位氨基酸序列可能存在蓖麻毒素B链的功能模序，克隆表达这段模序后，其相对分子质量为20×103，经ELISA法检测复性后蓖麻毒素抗原性为28．71U／L；Hela细胞经FITC标记的rRicinB作用后其细胞膜表面和胞质均有绿色荧光产生。结论VVC中存在具有类似天然蓖麻毒素B链功能的模序，能与细胞膜表面结合并进入胞质，可能与创伤弧菌溶细胞素膜成孔和细胞毒活性有关。
- 王永明谢旦立金疆楼永良
- 关键词：创伤弧菌
- 重组创伤弧菌溶细胞素缬氨酸V201和V289突变对其活性的影响被引量：2
- 2012年
- 将重组创伤弧菌溶细胞素A(recombinant Vibrio vulnificus hemolysin,rVvhA)第201位和第289位的缬氨酸定点突变为甘氨酸,并表达rVvhAval201gly,val289gly突变蛋白。检测突变蛋白与未突变蛋白的溶血活性、对胞内钙离子浓度、钾离子外流及对细胞损伤的影响。结果显示,与rVvhA相比,rVvhAval201gly,val289gly的溶血活性和细胞毒性均降低,诱导人类脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVEC)凋亡、胞内钙离子内流和钾离子外流等作用均受到抑制。实验结果表明,在创伤弧菌溶细胞素的活性发挥中,rVvhA中的V201和V289两个氨基酸与该蛋白质损伤靶细胞时引起胞内外离子平衡失调有关,并能影响该蛋白质的溶血活性和细胞毒作用。
- 郭雅君叶美萍王帅楼永良
- 关键词：创伤弧菌缬氨酸突变
- 钙离子对重组创伤弧菌溶细胞素诱导THP-1细胞损伤的影响机制被引量：1
- 2012年
- 目的研究重组创伤弧菌溶细胞素（rVvhA）诱导人单核细胞白血病细胞（THP-1）的凋亡机制及其Ca2＋的变化。方法采用CCK-8法、激光共聚焦显微镜结合Fluo3／AM法、流式细胞术结合AnnexinV-PI标记等检测rVvhA对THP-1细胞的影响，并观察胞内Ca2＋浓度变化。结果rVvhA可诱导THP-1细胞发生凋亡并引起细胞内ca2＋浓度升高，细胞内钙离子螯合剂BAPTA—AM处理组胞内钙离子升高幅度远高于细胞外钙离子螯合剂EGTA处理组。结论rVvhA具有诱导THP-1细胞凋亡的生物学活性，并能引起细胞内ca2＋浓度升高，升高的Ca2＋主要源于胞外钙离子内流。
- 王永明郭秋史玢谢旦立楼永良
- 关键词：创伤弧菌钙离子
- 重组创伤弧菌溶细胞素诱导THP-1细胞损伤的机制研究
- 2013年
- 目的：研究重组创伤弧菌溶细胞素（rVvhA）对人单核细胞白血病细胞（THP-1）的损伤机制及其钙离子通道的研究。方法采用倒置显微镜、CCK-8法、Fluo3/AM法、caspase 活性检测等方法测定rVvhA对THP-1细胞的影响，并研究胞外Ca2＋的内流途径。结果 rVvhA作用后细胞形态学变化明显，细胞皱缩、变形甚至裂解，且呈剂量依赖性。12μg/ml rVvhA 作用THP-1细胞1 h后胞外K＋浓度升高，作用6 h后胞外LDH浓度显著升高。 Verapamil、Mibefradil和SKF-96365均不能抑制rVvhA引起的Ca2＋内流。同时rVvhA可导致THP-1细胞的caspase-3和caspase-9活性升高，并呈时间依赖性。结论 rVvhA对THP-1细胞具有明显的损伤作用，且可能通过caspase-9/3途径诱导细胞凋亡，并能引起细胞内Ca2＋浓度升高，升高的Ca2＋可能通过细胞膜上形成的孔道被动入胞。
- 陆晓雅陈建林刘彪谢旦立楼永良
- 关键词：细胞损伤钙离子通道
- rVvhA作用于THP-1细胞NF-κB信号通路的研究被引量：1
- 2012年
- 研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)对人单核细胞系(THP-1)NF-κB信号通路的影响。应用CCK-8法检测rVvhA对THP-1细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察rVvhA作用后细胞的形态学变化和细胞内NF-κB p65的核转移情况;应用流式细胞仪和Westernblot检测rVvhA作用后细胞浆内和细胞核内NF-κB p65的表达情况;ELISA检测rVvhA作用于细胞后TNF-α、IL-6表达含量的变化。试验结果显示:rVvhA能够呈时间–剂量依赖性地抑制THP-1细胞的生长,且镜下可见明显的细胞形态学变化。激光共聚焦显示0.4 HU/mL rVvhA作用6 h后,THP-1细胞内NF-κB p65的核转移现象最明显;流式细胞仪结果显示0.6 HU/mL rVvhA作用2 h后,细胞内总的NF-κB p65表达量达到高峰;Western blot检测显示0.6 HU/mL rVvhA作用4 h时细胞核内NF-κBp65蛋白含量最高;ELISA显示TNF-α的表达在rVvhA作用的适当范围内呈时间–剂量依赖性变化;IL-6在0.6 HU/mL rVvhA作用时表达量最高,随后随着浓度的增加反而下降;NF-κB抑制剂能使IL-6表达量下调。实验证明rVvhA作用于THP-1细胞后能激活NF-κB信号通路,上调TNF-α、IL-6的表达,而NF-κB抑制剂能够下调IL-6的表达。
- 屠艳烨刘艳飞陈建林楼永良
- 关键词：创伤弧菌THP-1细胞NF-ΚBP65TNF-ΑIL-6
- rVvhA功能模序膜成孔的预测及细胞毒作用机制分析被引量：1
- 2012年
- 利用生物信息学预测rVvhA的141-335位氨基酸片段有膜成孔模序。基因克隆表达得到95%以上纯度的rMpf,电子透射电镜观察其能够抑制Hela细胞生长且呈剂量依赖性,即0.8,1.6,2.4μg/mL rMpf作用8 h后,细胞和线粒体形态均发生凋亡和坏死改变,细胞内活性氧产生明显,线粒体膜电位下降,mPTP荧光检测膜通道孔活性增强。以上结果表明,rMpf具有诱导Hela细胞损伤的生物学活性,可通过改变膜通透性引起细胞凋亡。
- 刘艳飞陈建林许玲楼永良
- 关键词：生物信息学凋亡线粒体活性氧
- 重组创伤弧菌溶细胞素诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的作用及其机制被引量：5
- 2010年
- 为了研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的作用及其机制。采用MTT法、普通光学显微镜和电子透射电镜、流式细胞仪结合Annexin V-PI标记法、caspase活性检测等方法测定rVvhA诱导HUVEC凋亡的作用。结果显示rVvhA能够抑制HUVEC生长。3.0溶血单位(HU)/ml和4.0 HU/ml的rVvhA作用HUVEC 8 h后,细胞和线粒体的形态发生凋亡改变,其中4.0 HU/ml处理组的凋亡率(51.73±1.96)%高于对照组(3.53±0.64)%和3.0 HU/ml处理组(12.83±5.00)%,具有剂量依赖性;4.0 HU/ml rVvhA诱导HUVEC凋亡过程中,caspase-3、caspase-9活性增加,并且具有时间依赖性,而caspase-8活性没有明显改变;4.0 HU/ml rVvhA加caspase-3抑制剂Ac-DEVD-FMK或caspase-9抑制剂Ac-LEHD-FMK的凋亡率分别下降到(14.2±3.47)%、(24.93±3.93)%。同时caspase-3、caspase-9活性也下降。结果表明rVvhA具有诱导HUVEC凋亡的生物学活性;其机制可能与依赖caspase的线粒体途径有关。
- 王波丁卉谢旦立楼永良严杰杨军赵志超
- 关键词：创伤弧菌人脐静脉内皮细胞凋亡CASPASE
- 创伤弧菌溶细胞素中类蓖麻毒素功能模序的细胞毒活性研究
- 2013年
- 创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)氨基酸序列的313-445位(Gi No.M34670)与蓖麻毒素B链(Ricinchain B,RTB)的一段高度同源,为类蓖麻毒素。基因克隆表达创伤弧菌溶细胞素类蓖麻毒素(rRicin B),Ni2+亲和层析法及透析复性法进行纯化、复性。用纯化的rRi-cin B免疫日本大耳兔获得多克隆抗体,兔抗rRicin B多克隆抗体经盐析法、分子筛纯化后,得到较纯的IgG分子。免疫印迹结果显示,抗rRicin B多克隆抗体与纯化抗原呈现特异性反应条带。流式细胞术结果显示,rRicin B诱导细胞凋亡呈剂量依赖关系,多抗能够阻断其细胞毒性。至此,该工作成功制备了兔抗rRicin B的多克隆抗体,并证明了创伤弧菌溶细胞素结构基因的类蓖麻毒素功能域具有细胞毒活性,能诱导Hela细胞凋亡,且其细胞毒活性能被其多抗成功阻断。
- 许玲谢旦立张刘丽楼永良
- 关键词：创伤弧菌多克隆抗体凋亡
