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HER2基因表达与骨肉瘤预后被引量：4: 2006年; 目的:研究骨肉瘤中HER2基因的表达与临床预后的关系。方法:对82例骨肉瘤患者的临床病理资料进行回顾性研究,应用HER2单克隆抗体对组织切片进行免疫组织化学染色,并将上述资料与患者的预后进行分析。结果:骨肉瘤患者HER2表达与患者预后相关(P<0.05),HER2高表达的骨肉瘤患者预后较差。结论:HER2检测是骨肉瘤预后判断的一项有价值的指标;同时,HER2为骨肉瘤的治疗提供一种可能的生物靶点。; 裘秀春单乐群许彦鸣马保安周勇龙华李钊杨连甲范清宇; 关键词：骨肉瘤预后免疫组织化学

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用被引量：1: 2008年; 目的:构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促调亡作用。方法:通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪(FCM)检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因(PEⅡ)和tBid基因连接,构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv/tBid载体,转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,Annexin V染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果:流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv/tBid。重组质粒转染E10细胞后,间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达;细胞色素C在细胞质中出现;细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高(16.1% vs 4.5%);TUNEL染色显示,E10细胞出现典型的凋亡特征。结论:重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达,并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。; 裘秀春单乐群纪振钢杨彤涛龙华许彦鸣周勇马保安杨安钢范清宇; 关键词：TBID 人表皮生长因子受体2 融合蛋白骨肉瘤细胞

重组LacZ复制缺陷型腺病毒的构建和鉴定被引量：1: 2006年; 目的:构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。方法:用AdEasy-1TM系统,在大肠杆菌中同源重组,构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-LacZ)。重组腺病毒在HEK293细胞内包装并扩增,测定病毒滴度、电镜鉴定病毒存在、斑点杂交检测其复制缺陷性,然后感染HeLa细胞X-gal染色检测LacZ的表达情况。结果:成功构建了重组LacZ腺病毒表达载体,包装获得的重组腺病毒的滴度为1.58×109PFU/m l。在转染的细胞和感染的靶细胞内均可检测到LacZ的表达。电镜下可见感染的HEK293细胞核内含晶格状结构的腺病毒包函体。斑点杂交提示重组病毒为复制缺陷型,其基因转移百分率和感染强度和感染时间有一定的相关性。结论:成功构建了表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。; 裘秀春许彦鸣马保安周勇单乐群杨彤涛于翠娟孟艳玲杨安钢范清宇; 关键词：腺病毒表达载体 LACZ

重组tBid融合蛋白基因的构建及其在HeLa细胞中的分泌表达: 2006年; 目的:构建重组的Immuno-tBid基因,并检测其在HeLa细胞中的分泌表达。方法:将肿瘤表面抗原HER2的单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PE253-364aa)和tBid基因连接,并在5'端连接前导肽基因,构建成Immuno-tBid(e23sFv-PEII-tBid61/tBid76)基因。将其克隆到pCMV载体并转染HeLa细胞,G418筛选获得阳性克隆,Genomic-PCR和RT-PCR分别扩增相应的重组基因片段。建株的HeLa细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测。并通过间接免疫荧光染色和细胞计数观察建株的HeLa细胞生长和形态变化。结果:成功构建了重组的Immuno-tBid基因的真核表达载体(pCMV-e23sFv-PEII(253-364)-tBid61/tBid76)。稳定转染HeLa细胞,获得G418抗性的阳性HeLa细胞克隆,Genomic-PCR检测证实目的基因已整合到细胞基因组中。RT-PCR检测表明目的基因在RNA水平上的表达。细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测,证实建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。间接免疫荧光染色和核染色结果显示,分泌Immuno-tBid蛋白的HeLa细胞呈标准的S型曲线生长,形态正常。结论:成功构建了重组的Immuno-tBid基因,建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。; 裘秀春许彦鸣于翠娟赵晶孟艳玲杨彤涛龙华马保安周勇王成济杨安钢范清宇; 关键词：TBID 抗原分泌表达

人重组型caspase-6融合蛋白对骨肉瘤E10细胞的靶向促凋亡作用: 2007年; 目的:探讨Her2靶向重组人caspase-6融合蛋白对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用。方法:将抗Her2单链抗体基因e23sFv与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PEⅡ)和重构型caspase-6基因连接,构建成immunocaspase-6(e23sFv-PEⅡ-caspase-6)基因,将其克隆入质粒pCMV中,阳离子脂质体包裹法转染E10细胞;HE染色、电子显微镜观测转染后细胞形态学变化;免疫细胞化学染色检测目的基因表达;MTT法检测目的基因转染后细胞的生长状况。结果:目的基因转染后,HE染色、电子显微镜观察到细胞呈现典型的凋亡特征,免疫细胞化学染色检测出caspase-6的表达,MTT法检测发现细胞的增殖被明显抑制(P≤0.01)。结论:Her2靶向重组的人caspase-6融合蛋白能识别、结合Her2+骨肉瘤E10细胞,并促使其凋亡。; 单乐群周本根裘秀春许彦鸣张正平李伟高杰马保安杨安钢范清宇; 关键词：骨肉瘤融合蛋白

靶向survivin的siRNA对骨肉瘤细胞MG63的抑制作用被引量：7: 2008年; 目的:探讨针对人survivin基因的siRNA对骨肉瘤细胞MG63的体内外抑制作用。方法:合成survivin基因的RNA干涉(RNA interferance,RNAi)特异性片段,构建survivin特异性的RNA干涉载体pSiS,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。细胞计数检测细胞生长情况;Western blotting检测细胞中survivin蛋白表达的变化;通过Annexin V法染色和流式细胞术检测细胞凋亡;观察裸鼠皮下MG63移植瘤的形成。结果:成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体pSiS,获得了稳定转染的细胞MG63/pSiS。与MG63、MG63/pSi(空质粒对照细胞)相比,MG63/pSiS细胞生长曲线十分平缓,差异有统计学意义(P<0.01);Western blotting显示,MG63/pSiS细胞中survivin蛋白表达减少,细胞凋亡率增加(P<0.01)。MG63/pSiS移植瘤形成明显受到抑制。结论:Survivin特异性siRNA可明显促进骨肉瘤细胞MG63的凋亡,抑制该肿瘤细胞体外生长和体内移植成瘤。; 杨彤涛李存孝高杰黄立军张勇周勇范清宇马保安; 关键词：骨肉瘤 SURVIVIN RNA干涉

HER2靶向重组截短型Bid片段融合蛋白对骨肉瘤细胞的促凋亡作用被引量：1: 2007年; 目的:观察人上皮细胞生长因子受体2(HER2)靶向重组的活性截短型Bid(tBid)融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用。方法:将抗HER2单链抗体基因e23sFv、与绿脓杆菌外毒素(PE)的转膜结构域基因(PEII)和tbid基因连接,构建成immuno-tbid(e23sFv-PEII-tbid)基因,将其克隆入真核表达载体pCMV中,转染SOSP-9607细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,通过AnnexinⅤ染色、流式细胞仪检测观察其促凋亡作用。结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测出tB id的表达,SOSP-9607细胞出现明显的固缩,核浓缩等凋亡特征。AnnexinⅤ染色、流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,凋亡率为42%,对照组细胞仅6%,表明细胞膜表面有磷脂酰丝氨酸外翻,提示重组immuno-tbid基因表达后有促凋亡作用。结论:重组immuno-tbid基因可在转染的SOSP-9607细胞中表达,并诱导其细胞凋亡。; 纪振钢裘秀春杨彤涛龙华马保安周勇张明华许彦鸣杨安钢范清宇; 关键词：融合蛋白细胞凋亡

人重组caspase-6融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞靶向促凋亡作用被引量：2: 2007年; 目的:探讨Her2靶向重组的caspase-6融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用。方法:将抗Her2单链抗体基因e23sFv与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PEⅡ)和活性caspase-6基因连接,构建成Immunocasp-6(e23sFv-PEⅡ-casp-6)基因,将其克隆入真核表达载体pCMV中,转染SOSP-9607细胞,间接免疫荧光法检测目的基因表达和细胞形态学变化,通过AnnexinV染色、流式细胞术、MTT法检测来观察其促肿瘤细胞凋亡的作用。结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测出caspase-6的表达,SOSP-9607细胞出现明显的核浓缩、碎裂;电镜观察到细胞质浓缩,胞内空泡,核染色质浓集等典型的凋亡特征;MTT法检测发现细胞的增殖明显被抑制;AnnexinV染色流式细胞术检测可见明显的凋亡细胞,凋亡率为31.4%,较对照组细胞(凋亡率为6.0%)有非常显著的增加(P<0.01)。结论:重组Immunocasp-6基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并诱导细胞发生凋亡。; 周本根许彦鸣裘秀春杨彤涛纪振钢苟永胜任民周勇杨安钢范清宇; 关键词：CASPASE-6 HER 融合蛋白骨肉瘤

人重组型caspase-6融合蛋白对骨肉瘤的促凋亡作用: 2010年; 目的探讨人类表皮生长因子受体2（Her-2）靶向重组型caspase-6融合蛋白对骨肉瘤的促凋亡作用.方法将抗Her-2单链抗体基因e23sFv、绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和重组型caspage-6基因连接,构建成Immunocasp-6（e23sFv-PE Ⅱ-casp-6）融合蛋白,将其亚克隆入真核表达载体pCMV中,构建pCMV-e23sfv-PE Ⅱ-caspase-6载体（简称pCMV-6）.将荷瘤裸鼠随机分为治疗组和对照组,采用阳离子脂质体包裹法,将pCMV-6和pCMV分别肌肉注射入荷瘤裸鼠身上,观察肿瘤体积和裸鼠体重的变化,并称取肿瘤重量.采用HE染色法观察肿瘤组织形态学变化,采用末端脱氧核苷酸转移酶标记技术（TUNEL）检测肿瘤组织的凋亡形态,采用免疫组织化学染色检测目的基因的表达.结果对照组的肿瘤体积、肿瘤重量和裸鼠体重分别为（975.09±49.76）mm3、（1.08±0.16）g和（4.07±0.49）g,治疗组分别为（376.01±265.18）mm2、（0.64±0.18）g和（6.20±1.14）g.HE染色和TUNEL法检测显示,治疗组裸鼠肿瘤组织呈现出典型的凋亡特性,而对照组裸鼠肿瘤组织结构正常.免疫组织化学染色显示,caspase-6在治疗组裸鼠肿瘤组织中呈阳性,而在对照组肿瘤组织和肌肉组织中呈阴性.结论人重组型caspase-6融合蛋白能靶向性识别、结合Her-2阳性的骨肉瘤细胞,并诱导其发生凋亡,为骨肉瘤的临床治疗提供了一定的实验基础.; 周本根裘秀春许彦鸣范清宇; 关键词：骨肉瘤重组融合蛋白质类 CASPASE-6 人类表皮生长因子受体2 裸鼠

中低温度热疗诱导骨肉瘤细胞株凋亡被引量：2: 2007年; 目的:研究加热诱导成骨肉瘤细胞株(OS-9901)凋亡,为中低温度热疗辅助成骨肉瘤综合治疗提供理论依据.方法:成骨肉瘤OS-9901细胞株分别经不同温度的热疗作用1h,用TUNEL法染色及计数、透射电子显微镜观察其对骨肉瘤细胞株的诱导凋亡作用.同时通过免疫组织化学染色,观察43℃1h热疗对成骨肉瘤细胞株OS-9901的Bcl-2蛋白表达的影响.结果:43℃作用1h的成骨肉瘤细胞株继续培养6h后出现大量异常细胞,透射电镜观察可见有典型的细胞凋亡特征性形态改变.TUNEL法染色后通过计数可见有42%的细胞凋亡比例.免疫组织化学显示,43℃作用1h的成骨肉瘤细胞株6h后Bcl-2蛋白的表达明显减少.结论:43℃作用1h可以诱导成骨肉瘤细胞株OS-9901凋亡.加热后成骨肉瘤细胞Bcl-2表达减少,从而进一步诱导发生细胞凋亡,为热疗诱导肿瘤细胞凋亡的机制提供了部分理论依据.; 单乐群裘秀春马保安周勇王育才张殿忠范清宇; 关键词：骨肉瘤

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国家自然科学基金(30471988)

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