江苏省“333工程”培养资金资助项目(2002)
- 作品数：8 被引量：30H指数：4
- 相关作者：李军韩亚萍黄祖瑚刘源陈念更多>>
- 相关机构：江苏省人民医院江苏丹阳市人民医院南京医科大学更多>>
- 发文基金：江苏省医学重点学科基金江苏省卫生厅医学科技发展基金江苏省“333工程”培养资金资助项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 肝病患者的肝组织单细胞悬液与外周血中淋巴细胞亚群的分析比较被引量：7
- 2005年
- 目的探讨肝脏组织单细胞悬液的制备方法,了解慢性肝病患者的肝组织和外周血的淋巴细胞亚群差异。方法分别选择慢性乙型肝炎(CHB)14例、自身免疫性肝炎(AIH)4例和原发性肝细胞癌(HCC)3例,在超声引导下经皮作肝脏穿刺活检,用单细胞制备仪或物理研磨方法将肝组织制备成单细胞悬液,肝组织中淋巴细胞经4种特异性荧光抗体标记,在流式细胞仪(FCM)上作四色荧光分析,并与外周血测定结果比较。结果单细胞制备仪和物理研磨方法制备的肝组织单细胞悬液,细胞成活率分别为92.4%和91.5%;检测肝组织单细胞悬液中淋巴细胞亚群,正常对照组和慢性肝病各组间差异均有显著性(P<0.05),AIH组和CHB组间差异有显著性(P<0.05)。而外周血中淋巴细胞亚群检测,HCC组和CHB组间差异有显著性(P<0.05)。肝组织和外周血相应项目比较差异均有显著性(P<0.05)。结论用2种方法制备单细胞悬液能满足FCM检测的特殊需要;肝脏组织中淋巴细胞与外周血的淋巴细胞亚群比例差异有显著性。
- 韩亚萍刘源李军陈念董莉蔡洁黄祖瑚
- 关键词：淋巴细胞亚群单细胞悬液肝脏
- 慢性HBV感染者肝组织HBV cccDNA的定量检测被引量：4
- 2007年
- 目的建立一种肝活检组织中 HBV 共价闭合环状 DNA(cccDNA)的定量检测方法。方法待检肝组织标本共21份,来源于江苏省人民医院肝脏手术患者,包括19份慢性 HBV 感染,其中 HBeAg(+)标本10份,HBeAg(-)标本9份,4份非 HBV 感染为阴性对照组,取 HBV DNA 阳性的患者外周血作为 rcDNA 组。检测方法的主要步骤为肝组织经蛋白酶 K 和细胞裂解缓冲液消化后,用液相抽提法提取核酸,将提取的核酸溶液分为2等份。1份用特异性降解单链 DNA 的核酸酶加以消化,纯化后使用跨缺口引物和 SYBR Green Ⅰ荧光染料进行实时荧光定量 PCR 分析;另1等份则用以-定量检测肝细胞看家基因(β-Globin)作为样本细胞参数。检测结果的特异性主要通过 PCR 反应产物的序列分析及 rcDNA 组结果的对照进行证实,HBeAg(+)组和 HBeAg(-)组 cccDNA 水平的差异通过两样本 t 检验进行分析。结果 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增产物的碱基数为350 bp左右,DNA 测序分析提示产物与目的片段的序列符合率为99%以上,且以 rcDNA 为对照的结果均为阴性,排除最有可能造成假阳性的 rcDNA 对结果的干扰。本方法对10 mg HBeAg(+)肝组织标本的cccDNA 的检测阳性率为100%。血清 HBeAg(+)的肝组织样本的平均 HBV cccDNA 水平高于HBeAb(+)的肝组织标本(P<0.05)。结论通过上述三种途径证实了本文所建立方法的特异性。应用 SYBR Green Ⅰ荧光染料和β-Globin 作为样本细胞参数所建立的实时荧光定量 PCR 方法检测肝细胞内 HBV cccDNA,具有较高的特异性、敏感性,且成本较低的特点。
- 李军宋培新韩亚萍刘婷黄祖瑚
- 关键词：乙型DNA
- 骨髓间充质干细胞移植在急性肝损伤大鼠肝脏内定植能力的实验研究被引量：4
- 2007年
- 目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在急性肝损伤大鼠肝脏内移植情况。方法:首先行大鼠骨髓间充质干细胞提取、分离和培养,传代扩增后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,用D-氨基半乳糖(1.5g/Kg)腹腔注射制备大鼠急性肝损伤模型,试验分三组(A、B、C组),经阴囊上静脉向肝损伤组(A组)及肝脏正常(C组)的大鼠移植标记BrdU的BMSCs 1～1.5×106,同时向肝损伤组(B组)的大鼠移植等量的生理盐水。2周后观察大鼠的存活率及肝功能恢复情况,并通过免疫组织化学方法检测大鼠肝脏中BrdU+细胞数量及分布。结果:移植2周A组、B组动物存活率、肝功能恢复情况无明显差异,肝损伤组(A组)及肝脏正常组(C组)大鼠肝脏均可检测到BrdU+细胞分布,A组与C组相比,A组BrdU+细胞数较多,分布更广,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:骨髓间充质干细胞可以在受损的肝脏及正常肝脏定植,定植的数量可能和肝脏是否受损伤相关。
- 陈念俞悦李军章莉莉刘源韩亚萍
- 关键词：骨髓间充质干细胞急性肝损伤细胞移植
- 外周血树突状细胞免疫治疗体外培养条件的优化被引量：11
- 2005年
- 韩亚萍李军刘源章莉莉黄祖瑚
- 关键词：树突状细胞体外培养条件细胞免疫治疗外周血抗肿瘤免疫治疗抗病毒治疗抗原递呈细胞
- HBeAg真核表达质粒在293T细胞中表达的研究被引量：1
- 2008年
- 目的:观察构建的真核表达质粒pJW4303/HBe在人胚肾细胞(293T)中的表达。方法:将构建好的质粒pJW4303/HBe经脂质体导入293T细胞中,分别在转染后3d、6d、9d及12d收集上清,同时对转染的细胞进行传代和冻存,传代的细胞收集上清,冻存的细胞复苏后收集上清。运用ELISA检测表达量的变化。结果:转染后3d、6d、9d及12d细胞上清液1 8稀释后HBeAg检测的OD值分别为1.047±0.093、1.494±0.112、0.998±0.087、0.678±0.124;不同时间转染传代3d后细胞上清液1 8稀释后HBeAg检测的OD值分别为0.943±0.135、1.378±0.127、0.791±0.145、0.505±0.098,不同时间转染冻存复苏3d后细胞上清液HBeAg检测的OD值分别为0.523±0.113、0.742±0.093、0.41±0.106、0.261±0.089。结论:质粒pJW4303/HBe转染293T细胞6d后HBeAg抗原表达量最高,经传代和冻存复苏后的转染细胞仍然能够表达抗原。
- 万玉峰韩亚萍蔡洁赵宏孔练花徐桂芳赵明丽李军
- 关键词：乙型肝炎病毒E抗原真核表达质粒传代
- 健康人单核细胞来源树突状细胞Toll样受体的表达模式分析被引量：3
- 2007年
- 目的体外诱导健康人外周血单核细胞来源的树突状细胞(dendritic cell,DC),动态定量分析DC表达Toll样受体(TLRs)的种类,探讨TLRs的表达水平与DC成熟的相关性。方法用羟乙基淀粉(HES)分离健康人外周血单个核细胞(PB-MC),经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)诱导培养DC,于培养5d加或不加肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-α(IFN-α),诱导其为成熟与未成熟两种类型的细胞。分别于3、5、7d用特异性单克隆抗体(单抗)标记未成熟DC(immature DC,imDC)和7d成熟DC(mature DC,mDC),在流式细胞仪(FACS)上检测,用CellQuest软件分析细胞表面共刺激分子(B7-1、B7-2)和MHCⅡ类分子以及细胞内、外TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9的表达百分率。结果健康人TLR3在imDC细胞膜表面的表达高于细胞内,并随着培养时间的延长有所下降;TLR4则主要表达在imDC细胞膜外,并伴随着干预性成熟而下降;TLR7在imDC细胞内的表达高于细胞表面,并随着imDC生长时间延长而逐渐增加,DC成熟时表达下降;TLR8和TLR9细胞内外均有表达,但细胞内稍高于细胞外,随DC成熟而表达增加。结论健康人单核细胞来源的DC表面TLRs的表达具有多样性,TLRs在DC的不同分化阶段表达模式不同,这种差异可能是DC通过TLRs识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)的基础,从而有效地调节或控制固有免疫与获得性免疫。
- 韩亚萍李军孔练花刘源陈念万玉峰黄祖瑚
- 关键词：TOLL样受体树突状细胞抗原提呈细胞固有免疫
- 脂质体介导乙型肝炎病毒核心抗原基因转染人树突状细胞的效率被引量：1
- 2007年
- 目的观察脂质体介导HBcAg基因转染来源于人外周血单个核细胞(PBMC)树突状细胞(DC)的转染效率。方法用HES离心沉淀法分离人外周血PBMC,经粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养DC,培养第5天以阳离子脂质体为载体将报告基因GFP(DNA:脂质体比例为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)及HBcAg基因(DNA∶脂质体1∶5)导入DC,于72h经流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达率,于48、72、96、120h流式细胞仪检测HBcAg的表达率。将基因转染后的DC与自体淋巴细胞混合培养,检测其细胞内γ干扰素(IFN-γ)、IL-4表达水平。结果倒置显微镜下观察脂质体转染后DC的的形态无明显变化。报告基因GFP与脂质体比例不同,其转染效率有差异,72h的表达率为37.12%(1∶3)、48.55%(1∶4)、52.13%(1∶5)、50.75%(1∶6)。HBcAg基因转染DC后48、72、96、120h的HBcAg表达率分别为31.58%、55.80%、54.18%、56.99%。转染后DC与自体淋巴细胞混合培养后,淋巴细胞高表达IFN-γ,较少表达IL-4,呈现Th1为优势的免疫应答。结论应用阳离子脂质体能有效的将HBcAg基因转染到人PBMC来源的DC,转染72h后抗原表达稳定;转染HBcAg基因的DC仍以诱导Th1免疫应答反应为主。
- 孔练花李军韩亚萍陈念黄祖瑚
- 关键词：树突状细胞乙型肝炎脂质体转染
- 慢性丙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群与病毒载量的相关性分析
- 2007年
- 目的:分析慢性丙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群的变化以及与HCV病毒载量的相关性,探讨慢性HCV感染慢性化的免疫机理。方法:应用直接免疫荧光-流式细胞术检测47例慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞的相对数量,与35例正常健康人做比较;应用实时荧光定量RT-PCR对其外周血HCV病毒载量进行检测,将慢性HCV感染者分为两组进行比较分析。结果:外周血CD4+T淋巴细胞比例和CD4/CD8比值慢性丙型肝炎患者组低于正常人组(P<0.05),HCV RNA阳性组与HCV RNA阴性组之间的差异无统计学意义(P>0.05);NK细胞比例慢性丙型肝炎患者组高于正常人组(P<0.05),HCV RNA阴性组高于HCV RNA阳性组(P<0.05)。结论:慢性HCV感染者存在细胞免疫功能低下,NK细胞介导非特异性免疫的持续上调,在有效地清除了部分HCV病毒的同时,可能促进了持续性免疫性肝损伤。
- 宋培新韩亚萍孔练花刘源李军
- 关键词：慢性HCV感染淋巴细胞亚群病毒载量
