中央高校基本科研业务费专项资金(2012N06)
- 作品数：10 被引量：21H指数：3
- 相关作者：朱平巩婷李慧仙陈天娇王伟更多>>
- 相关机构：北京协和医学院药物研究所中国医学科学院北京协和医学院中国医学科学院更多>>
- 发文基金：中央高校基本科研业务费专项资金国家科技重大专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 天然海水高盐条件对海绵相关细菌抗菌活性及次级代谢产物的影响被引量：1
- 2014年
- 海洋微生物生活在高盐、高压、低温、低光照、寡营养、弱碱性的海洋环境中，因而形成了独特的生理特征和代谢机制，可产生与陆生微生物结构与活性迥然不同的次级代谢产物，如生物碱、萜类、环肽类和聚酮类等[1-2]，成为海洋药物的重要来源之一。从海洋放线菌中分离得到的salinisporamide A 已经完成了 I 期临床研究，用于治疗多发性骨髓瘤[3]。以从海洋真菌 Aspergillus sp. CNC-139中获得的化合物为模板合成的 plinabulin（NPI-2358）已经进入II 期临床研究，用于治疗非小细胞肺癌[4]。来自于卡纳里水域深海沉积物中的链霉菌 NTK937产生的 caboxamycin是一种新型的苯并噁唑抗生素，显示出较强的抗菌活性，对革兰阳性菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）IC50仅为8μmol/L[5]。海洋是一个特殊的生态系统，据文献报道，通过模拟海洋环境的拟生态培养，可以诱导海洋真菌产生新的活性代谢产物[6-9]。同时有研究表明，高盐条件造成的极端环境（如高渗透压和营养剥夺等）可以激活生物体内的沉默基因或次级代谢产物合成酶，进而使海洋等来源的耐盐真菌产生新的活性化合物[10-11]。另据文献报道，培养基盐度对海洋真菌的活性物质具有显著影响，其生物活性和活性物质的种类和产量可能有较大的差别[12-13]。但是，应用天然海水培养基探讨海洋来源细菌的抗菌活性、次级代谢产物的 HPLC化学指纹的报道较少，本实验室曾研究报道天然海水对海绵相关细菌的抗菌活性有影响[14]。另有文献对细菌 HPLC 化学指纹研究进行了报道[15-17]，此外，有文献报道天然海水可影响细菌的生长[18-19]。本文以海绵相关细菌为主要研究对象，初步开展了相关探索，以期获得具有良好抗菌活性且次级代谢产物丰富的菌株。
- 甄心巩婷崔美子王瑞杉朱平
- 关键词：次级代谢产物抗菌活性高盐海绵ASPERGILLUS
- 海洋真菌杂色曲霉F62丁内酯类化合物研究被引量：6
- 2014年
- 为了深入研究相似蜂海绵相关真菌杂色曲霉F62的活性代谢产物,采用硅胶柱、凝胶柱色谱和HPLC等分离手段对其大米固体发酵物的乙酸乙酯提取物进行分离,并利用质谱和核磁共振等现代波谱学技术对其结构进行鉴定,从中共得到6个丁内酯类化合物,分别为丁内酯Ⅰ(1)、丁内酯Ⅱ(2)、丁内酯Ⅲ(3)、丁内酯Ⅳ(4)、丁内酯Ⅶ(5)、Aspernolides A(6),其中化合物1在10μmol/L时表现出较强的抗炎活性,其IC50值为8.73μmol/L。
- 巩婷董世豪朱平
- 关键词：次生代谢产物丁内酯
- 丰肉结海绵相关真菌产黄青霉HLS111菌株活性代谢产物研究被引量：1
- 2014年
- 目的对我国南海水域丰肉结海绵相关真菌产黄青霉菌HLS111的活性代谢产物进行研究。方法采用HPLC-DAD技术与活性筛选相结合的方法,通过硅胶柱、凝胶柱及HPLC等色谱方法对HLS111发酵产物进行分离纯化;通过核磁共振、质谱等波谱分析手段对分离得到的化合物进行结构鉴定;并对单体化合物进行抗肿瘤、抗HIV、抗炎活性测定。结果分离得到12个化合物。其中2个黑麦酮酸类化合物:黑麦酮酸F(1)和D(2);4个生物碱类化合物:环(L-色氨酸-L-苯丙氨酸)(3)、citreoindole(4)、meleagrin(5)、脑苷脂B(6);4个甾体类化合物:麦角甾醇(7)、(22E,24R)-5α,8α-过氧化麦角甾-6,22-烯-3β-醇(8)、globosterol(9)、β-谷甾醇(10);1个三萜类化合物:24-亚甲基环木菠萝烷醇-反式阿魏酸(11);1个蒽醌类化合物:大黄素(12)。对化合物4的氢谱、碳谱数据进行了归属。初步的药理研究表明,黑麦酮酸类化合物表现出较强的抗肿瘤活性,化合物citreoindole表现出一定的抗HIV及抗炎活性。结论海绵相关真菌产黄青霉HLS111菌株体现了次生代谢产物化学结构的多样性;黑麦酮酸类化合物为产黄青霉HLS111的主要抗肿瘤活性成分。
- 巩婷孙传英甄心邱君志杨金玲朱平
- 关键词：抗HIV药
- 紫花地丁中抗甲型H1N1流感病毒的环肽被引量：6
- 2014年
- 本研究从紫花地丁全草中分离得到3个环肽。其中,varv peptide E和cycloviolacin Y5已报道,另一种新的环肽命名为cycloviolacin VY1。环肽经DTT还原、碘乙酰胺(IAA)烷基化,再分别利用赖氨酸内肽酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解,通过MS/MS质谱解析酶解肽段的碎片离子鉴定出其结构。稳定性分析再次证实其具有一般环肽的特性,能较好地耐受胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解及耐热变性。体外活性评价结果表明其对甲型H1N1流感病毒具有较强的抑制作用,其半数抑制浓度(IC50)为(2.27±0.20)μg·mL-1。它是报道的第一个具有抑制甲型H1N1流感病毒的活性环肽。
- 刘忞之杨燕张书香唐亮王惠敏陈成娟申竹芳程克棣孔建强王伟
- 关键词：紫花地丁环肽
- 7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl-p1-2基因突变库与高通量筛选体系的构建
- 2013年
- 对7－木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl－p1－2基因进行定向进化的初步研究，确定易错PCR条件、优化克隆连接方法、建立基于48微孔板高通量筛选模型。利用易错PCR技术对Lxyl－pl－2基因进行随机突变，比较不同浓度M聋’进行易错PCR，每组随机挑取10个克隆进行测序。序列分析表明：在M聋’浓度为7mmol／L条件下，碱基平均突变率为0．12％，即对于Lxyl－p1－2基因（2．4kb）来说，每个基因序列平均有3个碱基突变，达到构建突变文库的频率要求，选择该条件作为易错PCR条件。利用in-fusion技术将Lxyl－p1－2突变基因克隆到pPIC3．5K载体中，获得大量重组突变质粒。该研究优化了in-fusion连接反应中基因片段和载体片段的摩尔比，并探讨了基因片段与载体片段问同源序列长度对in—fusion连接效率的影响。试验结果表明：基因片段与载体片段的摩尔比最佳梯度为5：1；同源序列长度的选择成为影响in—fusion连接效率的关键因素之一。当同源序列长度为100bp时连接效率达到最大值，且显著高于同源序列长度为15～50bp的连接效率，此时阳性重组率提高至90％左右。与常规酶切一连接法相比，in-fusion法具有明显优势，同时将克隆周期由3～4d缩短为1～2d。挑取单菌落，在48微孔培养板上进行培养、诱导表达2d后，取菌液进行酶活测定（底物PNP-Xyl）。以野生型为例，β-木糖苷酶的酶活013405均数μ=3．415，其数据组标准差为δ=±0．078，数值符合正态分布的原理，建立统计学野生型均数分布范围和48微孔板高通量筛选，为后续突变体筛选提供基础。
- 李慧仙朱平
- 关键词：易错PCR
- 丰肉结海绵相关放线菌LS-298活性产物
- 2013年
- 对分离自南海丰肉结海绵的相关链霉菌LS-298菌株的活性代谢产物进行研究,以抗菌活性和化学筛选相结合为指导,采用硅胶柱、凝胶柱以及制备HPLC等色谱方法对LS-298发酵产物进行分离纯化,通过核磁共振、质谱等波谱分析手段对分离得到的化合物进行结构鉴定,以滤纸片扩散法及MTT法分别检测其抗菌和抗肿瘤活性。共分离鉴定了17个化合物,其中1个新化合物,环(脯氨酸-4-羟基-缬氨酸)(1),16个已知化合物分别为尿嘧啶核苷(2),2′-脱氧尿嘧啶核苷(3),邻苯二甲酸正丁二酯(4),邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(5),3-甲酰胺-吲哚(6),环(脯氨酸-赖氨酸)(7),环(脯氨酸-苯丙氨酸)(8),环(脯氨酸-酪氨酸)(9),环(脯氨酸-亮氨酸)(10),meleagrin(11),5-hydroxyectione(12),棘霉素(echinomycin)(13),光黄素(14),N-[2-(1H-indo-l 3-yl)-2-oxo-ethyl]-acetamide(15),3-甲酰胺吡啶(16),替达霉素B(tirandamycin B)(17)。其中,棘霉素和替达霉素B为首次从同一株放线菌中分离得到,且后者目前仅在海洋放线菌中被发现,两者不仅具有较强的抗菌活性,亦具有很强的体外抗肿瘤活性。
- 甄心巩婷朱平
- 关键词：链霉菌属代谢产物抗菌抗肿瘤
- 同源区段长度对In-Fusion技术连接效率的影响被引量：5
- 2013年
- 目的在目的基因原载体（DNA 模板）与克隆载体相同的条件下，探讨了 PCR 扩增片段（含目的基因）的末端与载体间同源区段长度对 In-Fusion 连接效率的影响，并建立以In-Fusion 技术为基础的高通量克隆方法。方法以糖基水解酶 Lxyl-p1-2（2.4 kb）基因突变库的构建为例，设计引物使目的基因的两端分别与线性化载体末端含有15~200 bp 重叠序列，并通过易错 PCR 方法获得含目的基因的 PCR 扩增片段，运用 In-Fusion 技术将 PCR 扩增片段定向克隆至表达载体 pPIC3.5K 中。结果对于长度大约为2.4 kb 的较大片段 DNA 的克隆， PCR 扩增片段的末端与载体间最适同源区段长度约为100 bp，此时连接效率最高，其阳性重组率高达90%左右，是常规酶切连接法的3倍。与后者相比，该技术将克隆周期由3~4 d 缩短为1~2 d。结论优化的同源区段长度可以显著提高 In-Fusion 技术对于2.4 kb 目的基因与载体的连接效率，该方法尤其适用于定向进化过程中基因突变库的构建。
- 李慧仙朱平
- 关键词：高通量克隆
- 工程酵母细胞高压破碎、蛋白低温保藏和去糖基化处理对7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-2活性的影响
- 2014年
- 紫杉醇主要来源于红豆杉，作为一种“重磅炸弹”式的抗肿瘤药物，自1992年12月被美国 FDA批准上市以来，一直是销售额最大的植物抗肿瘤药。但由于紫杉醇的天然含量极低，约占含量最高的树皮部位的万分之二，加之红豆杉生长缓慢，早期从野生红豆杉中获取紫杉醇曾给红豆杉资源造成毁灭性破坏。目前主要依靠化学半合成或苗圃栽培手段制取。苗圃栽培虽然对保护野生红豆杉资源具有积极意义，但栽培红豆杉中紫杉醇含量低微的本质没有发生改变。另一方面，红豆杉中存在着大量的紫杉醇结构类似物，其中包括含量数十倍于紫杉醇的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，而后者在脱除木糖基之后形成的10-去乙酰紫杉醇仅需在 C10位乙酰化即可产生紫杉醇[1]。如能将这类副产物转变成紫杉醇，不仅可以减少其对环境的污染，还可以“变废为宝”，大大提高红豆杉资源的利用率。脱除木糖基可用化学法或生物酶法来完成，其中后者的专一性强、环境友好。但由于天然细胞中β-木糖苷酶的酶量普遍偏低，用筛选得到的微生物直接进行转化效率不高[2-3]，本实验室已尝试用基因工程方法解决这一问题。我们已从具有转化7-木糖-10-去乙酰紫杉醇为10-去乙酰紫杉醇能力的真菌香菇中克隆得到了7-木糖紫杉烷糖基水解酶 LXYL-P1-2，该酶隶属于糖基水解酶的第3家族，是一种全新的和双功能的β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，能高效且专一性地水解包括7-木糖-10-去乙酰紫杉醇在内的7-木糖紫杉烷的木糖基，生成相应的7-羟基紫杉烷。已对该酶及其重组菌开展了酶的表征、高密度发酵与生物催化等研究[4-6]。本文报告工程酵母细胞高压破碎条件、蛋白低温保藏和去糖基化处理对 LXYL-P1-2酶活性的影响，为利用纯化的重组酶进行酶结构与功能关系等的研究提供保障。
- 陈天娇朱平
- 关键词：酵母细胞水解酶去糖基化低温保藏紫杉烷木糖
- 固定化分选酶介导的多肽环化被引量：1
- 2015年
- 多肽环化修饰是提高其稳定性和生物活性的重要手段之一,本研究建立了含有适于亲和色谱纯化的6个组氨酸和几丁质结合域两个融合标签的分选酶表达系统,纯化获得了目的蛋白;酶促动力学实验结果表明融合标签对其催化活性没有影响;以N-端含有3个甘氨酸和C-端含有分选酶识别序列的线性肽为底物研究了固定化酶催化线性肽的环化,该技术操作简单,易于酶促反应产物的分离纯化和固定化酶再利用,可直接用于环肽类药物的化学-酶法合成。
- 张书香刘忞之杨燕程克棣孔建强王伟
- 关键词：固定化酶环肽环化
- 7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl-p1-1及Lxyl-p1-2的催化特性被引量：1
- 2013年
- 糖基水解酶Lxy-l p1-1和Lxy-l p1-2是天然药物活性物质与功能国家重点实验室,卫生部天然药物生物合成重点实验室克隆自真菌香菇的重组蛋白,具有β-木糖苷酶/β-葡萄糖苷酶双重活性,能专一性水解脱除7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等的木糖基,生成的C-7位羟基化产物可以作为前体半合成重要的抗肿瘤药物紫杉醇或其类似物。前期工作显示:Lxy-l p1-1和Lxy-lp1-2的序列同源性高达97%,但后者的催化活性是前者的2倍以上;Lxy-l p1-2水解生色底物PNP-Xyl的最适温度为50℃,最适pH为4.0。为系统地观察两酶的催化特性,在对天然药物活性物质与功能国家重点实验室,卫生部天然药物生物合成重点实验室构建的工程酵母进行培养、诱导7 d后冷冻干燥菌体。将冷干的菌体破碎得到蛋白粗提物,再经过Ni亲和色谱和HPLC凝胶色谱法制备和纯化得到Lxy-l p1-1和Lxy-l p1-2重组蛋白。以生色底物PNP-Xyl和PNP-Glc及7-木糖紫杉烷底物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)与重组酶进行反应,重点测定Lxy-l p1-2水解XDT的最适温度和最适pH,并在最适条件下测定重组酶对不同底物的动力学参数。试验结果表明:Lxy-l p1-2水解底物XDT的最适温度为45℃,最适pH为4.5;动力学测定结果显示:Lxy-l p1-1和Lxy-l p1-2的β-葡萄糖苷酶活性均显著高于其β-木糖苷酶活性,这与之前的研究结果相一致;Lxy-l p1-1对于底物PNP-Xyl,PNP-Glc和XDT的kcat/Km值分别低于Lxy-lp1-2对于上述3种底物的kcat/Km值(0.77 s-1×mM-1,1.65 s-1×mM-1和0.30 s-1×mM-1vs.1.67 s-1×mM-1,2.85 s-1×mM-1和1.07 s-1×mM-1)。
- 陈天娇朱平
- 关键词：Β-木糖苷酶Β-葡萄糖苷酶
