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鼠骨骺干细胞免疫纯化和pTRE-PTHrP（38-94）反应质粒的构建被引量：6: 2008年; 目的免疫纯化新生大鼠骨骺干细胞，克隆甲状旁腺相关蛋白的中间片段PTHrP（38-94）基因并构建四环素反应性元件调控的反应质粒pTRE-PTHrP（38-94）。方法采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的骨骺干细胞，分别以FGFR-3抗体和PCNA抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定。提取骨骺干细胞的总RNA，以RT-PCR方法获得带有酶切位点PTHrP（38-94）基因片段，扩增的DNA片段与含潮霉素筛选标记的四环素反应性元件载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接，转化、扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定。结果免疫荧光证实所取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞；经限制性内切酶Bam HⅠ、NotⅠ酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒。结论运用显微取材和免疫纯化技术可以成功分离纯化骨骺干细胞；成功克隆PTHrP（38-94）基因并构建了反应质粒pTRE-PTHrP（38-94），为进一步明确PTHrP（38-94）片段的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础。; 张树威陈安民游洪波廖晖宋登新王江谢柏臻刘铁郭风劲; 关键词：干细胞免疫磁化分离

奇异摄动边值问题中的重正化群方法被引量：2: 2006年; 研究二阶奇异摄动边值问题:εd2ydx2+f(x)dydx+g(x,y)=0,y(0)=α,y(1)=β,其中ε是小参数.利用重正化群方法,构造了该边值问题解的一致有效渐近展开式.; 吴克义付苗苗吕显瑞; 关键词：奇异摄动边值问题

含联苯基团侧链聚酰亚胺液晶取向膜的研究被引量：5: 2006年; 制备了含联苯液晶基元侧链的三种聚酰亚胺(C 6-DABBE/ODPA,C 2-DABBE/ODPA和DABBE/ODPA),并进行了表面摩擦取向,用偏光显微镜(POM)、原子力显微镜(AFM)等方法对取向膜诱导液晶分子取向能力和打磨后取向膜的微观形貌进行了考察,研究了预倾角与摩擦强度,固化温度的依赖关系。结果表明,含6个亚甲基柔性间隔基的C 6-DABBE/ODPA取向膜对液晶分子有很好的取向能力,能获得10°以上的预倾角。打磨后的取向膜表面出现了约30 nm深的沟槽。且取向方向与打磨方向一致;随着摩擦强度的增大,预倾角呈减小的趋势;随着固化温度的升高,酰亚胺化程度提高,取向膜的预倾角也随之增大;在230℃对取向膜进行退火处理,能明显改善其取向性能。; 付祥峰帅亚顾宜; 关键词：聚酰亚胺

不同浓度血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的诱导效果比较被引量：6: 2008年; 背景:血清成分复杂,其中不仅存在促细胞生长因子,同时也存在细胞生长抑制因子,因此合适的血清浓度对于体外培养细胞的增殖和分化至关重要。目的:比较不同浓度的胎牛血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的影响。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-03/10在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成。材料:纯系清洁级新生24h内的SD大鼠8只,用于制备骨骺干细胞。胎牛血清为Gibco公司产品。方法:免疫磁珠分离纯化FGFR-3阳性的骨骺干细胞,稳定传至第3代后,分别用含1.25%,2.5%,5%,10%胎牛血清的软骨诱导培养基进行干预,诱导14d。主要观察指标:BrdU-ELISA法检测细胞增殖活性。应用免疫荧光染色和RT-PCR法检测细胞Ⅱ型胶原的表达。结果:骨骺干细胞向软骨细胞诱导14d后,10%胎牛血清组细胞增殖活性显著高于1.25%,2.5%,5%胎牛血清组(P<0.05);10%胎牛血清组Ⅱ型胶原免疫荧光染色阳性程度及Ⅱ型胶原mRNA的表达均明显强于其他3组。结论:含10%胎牛血清的软骨诱导液更有利于骨骺干细胞向软骨细胞方向分化。; 张树威陈安民宋登新谢伯臻王江祁军易磊郭风劲; 关键词：骨骺干细胞血清浓度分化软骨细胞

大鼠PTHrP亚基因的克隆及其真核反应质粒的构建被引量：2: 2008年; 目的:克隆甲状旁腺相关肽(PTHrP)亚基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并构建四环素反应性元件调控的反应质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139),为调控PTHrP亚克隆在软骨前体细胞中的表达打下基础。方法:提取骨骺干细胞的总RNA,以RT-PCR方法获得带有酶切位点的PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)基因片段,扩增的DNA片段分别与含潮霉素筛选标记的四环素反应性元件载体pTRE-2Hyg双酶切后连接,转化扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定。结果:经酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒。结论:成功克隆出PTHrP亚克隆基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139),为进一步精确调控PTHrP亚基因的表达奠定了基础。; 张树威陈安民郭风劲谢柏臻祁军王江易磊李昆朋; 关键词：骨骺干细胞

pTet-on骨骺干细胞株的建立和pTRE-甲状旁腺相关蛋白（1—36）反应质粒的构建被引量：1: 2008年; 目的建立pTet—on骨骺干细胞株，克隆甲状旁腺相关蛋白[PTHrP（1—36）]基因并构建反应质粒pTRE—PTHrP（1—36）。方法用脂质体介导的基因转染技术将pTet—on质粒转染于永生化骨骺干细胞，G418筛选得到稳定克隆，再瞬时转染pTRE-2Hyg—Luc质粒并筛选出高水平诱导、低背景表达的永生化骨骺干细胞系。以RT—PCR方法获得带有酶切位点PTHrP（1—36）基因片段，与载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接，转化扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定。结果筛选到1株诱导后荧光素酶的表达活性增加50倍的骨骺干细胞系；经酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒。结论筛选得到的永生化骨骺干细胞株受强力霉素诱导后能够低背景、高水平表达；成功克隆PTHrP（1—36）基因并构建了反应质粒pTRE—PTHrP（1—36），为进一步精确调控PTHrP（1—36）基因的表达奠定了基础。; 张树威陈安民李明辉祁军宋登新祝文涛廖晖郭风劲; 关键词：骨骺强力霉素基因表达调控甲状旁腺相关蛋白

基于基因组学的日本血吸虫序列分析平台的构建及应用: 2007年; 【目的】构建基于基因组学的日本血吸虫序列分析平台。【方法】基于工作站和Linux操作系统,利用公开的日本血吸虫或相关资源,收集有关生物信息学序列分析工具,并自行编写相关软件实现多种资源的有机整合。【结果】构建了本地化的日本血吸虫序列分析平台,在此基础上,自主设计了日本血吸虫EST序列的电子延伸系统、基于日本血吸虫EST数据库的同源全长cDNA序列检索系统和序列自动注释系统等。【结论】所构建的序列分析平台不仅可以完成常规的序列分析工作,还可成功地完成EST序列的电子延伸,同源全长cDNA序列的检索以及序列的自动注释,它可对大规模日本血吸虫序列进行快速、方便、高效的分析,为充分利用血吸虫基因组开展疫苗研究和新药开发提供了有效的技术手段。; 刘稳升胡斐吕志跃郑焕钦袁衡新吴忠道; 关键词：日本血吸虫基因组

日本血吸虫特异性膜蛋白的筛选及其中sj15蛋白编码序列的克隆被引量：2: 2007年; 目的:筛选日本血吸虫可能的特异性膜蛋白,并根据筛选结果在日本血吸虫成虫中尝试克隆某一可能具有免疫保护功能的预测蛋白的编码序列,为血吸虫病防治研究寻找新的疫苗候选分子或药物靶标。方法:以"Schistosoma japonicum"和"membrane or tegument"为关键词,在公共数据库NCBI进行查找并下载数据,建立本地化的日本血吸虫膜蛋白序列数据库,与本实验室建立的曼氏血吸虫、人类、大鼠及小鼠蛋白质数据库等进行多序列比对,筛选日本血吸虫特异性膜蛋白,同时通过CBS网站相应分析工具软件预测目的蛋白的特征和功能。针对其中可能有免疫保护功能的预测蛋白的预测编码序列设计引物,采用RT-PCR技术从日本血吸虫成虫中扩增出该编码序列,并克隆入pGEX-4T-1构建原核表达重组质粒。结果:共检索到153个理论推测的日本血吸虫膜蛋白序列,筛选出28个可能的日本血吸虫特异性膜蛋白;成功从日本血吸虫成虫中扩增出相对分子质量为15 000的预测蛋白的预测编码序列,暂命名为sj15基因,同时成功构建pGEX-4T-1-sj15重组质粒。结论:成功筛选出多个日本血吸虫特异性膜蛋白;从日本血吸虫成虫中成功克隆出GenBank公布的预测的sj15基因,证实了成虫中该预测基因的存在,并成功构建原核表达载体,为进一步的功能研究奠定了基础。; 张双民张莉滟刘稳升吕志跃郑焕钦吴忠道; 关键词：膜蛋白质类生物信息学

胰高血糖素样肽-1类似物对实验性糖尿病大鼠的治疗作用被引量：2: 2007年; 目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物对实验性糖尿病的治疗作用。方法:84只Wistar大鼠随机分为正常对照组、高脂饲料组、GLP-1类似物低剂量组、GLP-1类似物中剂量组、GLP-1类似物高剂量组、糖尿病模型组和阳性对照组。采用高脂饲料饲养和注射40 mg.kg-1STZ方法建立实验性糖尿病动物模型。GLP-1类似物低、中、高剂量(1、10和100μg.kg-1)治疗7及14 d后,采用酶化学方法检测空腹血糖(FPG);治疗14 d后,采用酶化学方法检测血清总胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL);采用放射免疫方法检测血清胰岛素和C肽。结果:GLP-1类似物高剂量组(100μg.kg-1)大鼠较糖尿病模型组进食量明显降低(P<0.01),中剂量组(10μg.kg-1)、高剂量组(100μg.kg-1)大鼠较糖尿病模型组饮水量均明显减少(P<0.01),各治疗组大鼠体重与糖尿病模型组比较差异均无显著性(P>0.05);GLP-1类似物高剂量组(100μg.kg-1)、中剂量组(10μg.kg-1)大鼠空腹血糖(FPG)较糖尿病模型组均明显降低(P<0.01);GLP-1类似物高剂量组(100μg.kg-1)大鼠血清TG较糖尿病模型组显著性降低(P<0.01);GLP-1类似物中剂量组(10μg.kg-1)、GLP-1类似物高剂量组(100μg.kg-1)LDL较糖尿病模型组均明显降低(P<0.01);GLP-1类似物中剂量组(10μg.kg-1)、高剂量组(100μg.kg-1)血清胰岛素和C肽水平较糖尿病模型组均显著升高(P<0.05)。结论:GLP-1类似物可以通过多种途径在治疗实验性糖尿病中发挥作用。; 赵海军徐琪张桂英刘娅于婷李鸿雁杨丽娜王洪莹谢丽波; 关键词：胰高血糖素样肽-1 胰岛素 C肽

大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建被引量：5: 2007年; [目的]分离、鉴定大鼠骨骺干细胞并建立永生化的大鼠骨骺干细胞株,为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源。[方法]采用Percoll不连续密度梯度离心法分离骨骺干细胞,利用电穿孔转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的质粒pCMVSV40T/PUR转染骨骺干细胞,经嘌呤霉素筛选,抗性克隆扩大培养。应用FGFR-3抗体和PCNA抗体进行免疫细胞化学染色,观察细胞的形态及其生长状况并绘制细胞生长曲线。用免疫细胞化学法和RT-PCR检测SV40Tag在转染细胞中的表达。[结果]转染后获得一个阳性细胞克隆,免疫细胞化学结果显示FGFR-3抗体染色阳性。SV40Tag抗体染色和RT-PCR结果显示SV40Tag已稳定转染入骨骺干细胞。转染细胞经扩大培养,命名为永生化骨骺干细胞。[结论]成功纯化大鼠骨骺干细胞并构建了SV40Tag永生化的骨骺干细胞株。; 张树威陈安民郭风劲胡伟华李明辉廖晖祝文涛宋登新; 关键词：骨骺干细胞永生化

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国家教育部博士点基金(2005)

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