国家科技重大专项(2011ZX10004-001)
- 作品数：63 被引量：345H指数：11
- 相关作者：熊衍文赵爱兰白向宁徐建国叶长芸更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所军事医学科学院中国疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家自然科学基金国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学理学更多>>
- 肠出血性大肠埃希菌感染人巨噬细胞产生白介素-1β水平的研究
- 2013年
- 目的通过构建EHEC O157∶H7野生株和突变株等不同菌株,来感染THP-1细胞,从而比较以上不同菌株的细胞毒和IL-1β等细胞因子的产生水平,同时比较使用有无胎牛血清(FBS)培养的THP-1对产生细胞因子水平的影响。方法将上述各菌株分别定量稀释于RPMI1640,5%FBS的细胞培养液中,在感染后2～10 h,用cytotox96试剂盒定量检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放。同时用Luminex和酶联免疫吸附试验试剂盒定量检测多种细胞因子的水平。结果 EHEC-O157∶H7-ehxA是THP-1细胞毒作用的主要贡献者,并可引起高水平IL-1β的产生;在OPT1-MEM无血清培养基中,野生型菌株和突变型之间IL-1β的产生差异则更加显著。结论 EHEC-O157∶H7-ehxA可诱导高水平IL-1β的产生,FBS能刺激细胞产生一定非特异性的IL-1β,这可能会导致高的背景和隐藏细胞株之间的真正差别。
- 王淑京程喻力熊衍文张晓嫒黄元铭任志鸿宋利琼
- 关键词：肠出血性大肠埃希菌人巨噬细胞白介素-1Β
- 基于上转发光免疫层析技术快速检测单核细胞增生李斯特菌被引量：4
- 2014年
- 目的建立可快速检测单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）的上转发光免疫层析技术（up-converting phosphor technology based lateral flow assay,UPT-LF）,即LM-UPT-LF。方法针对LM特异的p60蛋白制备单克隆抗体,并与上转发光纳米颗粒（up-converting phosphor nanoparticles,UCP-NPs）共价偶联作为结合物,采用双抗体夹心免疫层析模式建立LM-UPT-LF,并对其敏感性与特异性进行评价。结果建立了可快速检测LM的LM-UPT-LF平台,在样本〈10 cfu、10~99 cfu、100~1000 cfu绝对LM污染量条件下可分别在培养20、18、16 h检出阳性。其他13种食源性致病菌在高浓度（109cfu/ml）时无非特异性交叉。结论所建立的LM-UPT-LF操作简便快速,具有良好的敏感性和特异性,适用于一线病原调查与检测。
- 刘旭李春凤王晓英冯娜杨瑞馥王成彬周蕾
- 关键词：单核细胞增生李斯特菌
- 9种发热伴出疹病原体基因芯片检测方法的建立被引量：3
- 2017年
- 目的建立一种能同时、快速、准确地检测包括:麻疹病毒、风疹病毒、肠道病毒71型、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A16型、A组β型酿脓链球菌(溶血性链球菌)、伤寒沙门菌,9种发热伴出疹病原体的化学发光基因芯片的方法。方法根据9种病原体特异基因中的高度保守区序列设计引物与探针,进行多重不对称PCR扩增,将带有标记的扩增产物与带有特异性探针的芯片杂交,经洗涤、化学发光显色后进行结果分析。经多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件的优化,评价该芯片的特异性、灵敏度和重复性。实时荧光PCR法与芯片法分别检测肠道病毒EV71梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度。结果共筛选出9对特异性扩增引物和11条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性、灵敏度和重复性。质粒参考品和体外转录RNA参考品的最低检测限为3×10~3拷贝/反应,芯片法的灵敏度为实时荧光PCR法的1/10。检测74例临床样本的灵敏度为95%,特异性为85.7%,总符合率为93.2%。结论建立了一种可同时检测9种发热伴出疹病原体的化学发光基因芯片的检测方法,为发热伴出疹的临床诊断和流行病学调查提供了一种高通量的筛查手段。
- 徐胜平刘琪琦张严峻王升启
- 关键词：多重PCR基因芯片化学发光法
- 乙型脑炎病毒 EDⅢ蛋白的表达纯化及在 Array-ELISA 方法中的应用
- 2013年
- 目的：拟在大肠杆菌中高效表达纯化乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白，希望能为乙型脑炎（乙脑）病毒（ JEV）感染血清的诊断试剂盒提供候选抗原。方法针对乙脑病毒的EDⅢ蛋白设计特异的PCR扩增引物，对提取的乙脑病毒RNA进行RT-PCR扩增，获取目的基因并构建重组质粒，将重组质粒转入E．coli BL21中并在IPTG作用下表达目的蛋白。将表达的乙型脑炎病毒EDⅢ抗原系列稀释后与对照抗原同时点制在ELISA微孔板中，采用Array-ELISA技术同时检测临床JEV感染患者及正常人血清，并与间接免疫荧光方法的检测结果进行比较。结果成功克隆了JEV EDⅢ蛋白基因段，并在E．coli BL21中表达，成功获得EDⅢ蛋白。该重组蛋白可用于Array-ELISA方法，进行JEV感染血清的检测，并且与传统免疫学检测方法---间接免疫荧光法结果一致。结论该重组抗原可作为JEV感染血清检测的候选抗原。
- 郑旸康晓平李裕昌吴晓燕张晓松杨银辉
- 关键词：乙型脑炎病毒克隆
- 我国大肠埃希菌O157∶H7分离株大质粒pO157变异性研究
- 2013年
- 目的分析我国分离的大肠埃希菌O157∶H7菌株中大质粒pO157的变异情况。方法采用限制性内切酶酶切法分析质粒酶切图谱,而后采用嵌套引物进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,并用Southern blot进行验证,最后测序。结果根据酶切图谱将60株大肠埃希菌O157∶H7分为A～E 5个群,而进一步研究表明造成A群与C群HindⅢ酶切图谱的不同是由C群中的一个小质粒造成的。PCR结果显示A群与C群中的引物对5和25,B群中的引物对25得到的PCR条带与pO157出发菌株不同,其他均相同。测序结果显示造成引物对25在A～C群中与致病性大质粒pO157不同的原因是IS1310序列的插入。结论我国大肠埃希菌O157∶H7分离株致病性大质粒pO157相对保守,部分菌株中存在插入序列如IS1310,这也是造成我国大肠埃希菌O157∶H7 pO157质粒变异的主要原因。
- 徐雪芳伍建宏刘学通熊衍文徐建国
- 临床皮炎外瓶霉荧光定量PCR检测方法的建立被引量：4
- 2013年
- 目的 建立基于TaqMan探针技术的皮炎外瓶霉荧光定量PCR检测方法.方法 通过对皮炎外瓶霉ITS区域基因组序列（GenBank：JN675373.1）进行分析,设计合成特异性引物和荧光标记探针,优化荧光定量PCR反应条件.以临床标本中分离的皮炎外瓶霉为阳性菌株,及其他种类真菌和细菌作为阴性对照菌株,从特异性、敏感性及重复性方面对该方法检测效果进行评价.结果 该研究设计的引物和探针能扩增皮炎外瓶霉特异性序列.临床分离得到的皮炎外瓶霉在反应中有明显扩增曲线,而甄氏外瓶霉、棘状外瓶霉、烟曲霉、白色念珠菌、新生隐球菌、马内菲青霉等20株菌在CT值≤38范围内均未有扩增;利用基因重组构建的标准品完成了标准曲线的绘制,在1.0×103～1.0×107拷贝数（Cp）内具有良好的线性关系（R2=1.000）,最低可检出量为10 Cp/μL.结论 成功建立了荧光定量PCR检测皮炎外瓶霉方法,该法特异度强、敏感度高、重复性好,将有助于临床皮炎外瓶霉感染的早期诊断和针对性治疗.
- 王芳穆超赵静雅高莉胡小华韩黎田曙光
- 关键词：核糖体基因荧光定量聚合酶链反应
- 非O157产志贺毒素大肠杆菌分离株亚碲酸钾抗性水平及抗性基因簇分析被引量：1
- 2012年
- 目的了解我国部分地区非0157产志贺毒素大肠杆菌（Shigatoxi-producingEschen-richiacoli，STEC）分离株的亚碲酸钾抗性水平、抗性基因簇及其关系。方法使用平皿法检测亚碲酸钾抗性水平，采用PCR方法检测亚碲酸钾抗性基因簇。结果在所检测的39株非0157STEC中，仅有5株菌亚碲酸钾抗性水平介于128～512μg／ml，同时携带亚碲酸钾抗性基因簇（terABCDE）。另有2株菌的亚碲酸钾抗性水平为8μg／ml，3株菌为2μg／ml，其余29株菌均〈1μg／ml，且这34株菌ter-ABCDE均阴性。结论大多数非0157STEC分离株对亚碲酸钾敏感，在使用含亚碲酸钾的选择性培养基分离非0157STEC时应慎重。
- 白向宁赵爱兰孟琼徐建国熊衍文
- 人型支原体实时荧光聚合酶链反应检测方法的初步建立被引量：1
- 2012年
- 目的建立一种快速、灵敏和特异的人型支原体实时荧光聚合酶链反应(real-time PCR)检测技术。方法依据人型支原体gap基因保守区域使用Beacon Designer 7.0软件设计引物和探针,建立人型支原体real-time PCR检测方法并优化。对优化后的方法进行实验室灵敏度、特异度和检测限评价,并与聚合酶链反应(PCR)进行比较。结果该real-time PCR对于人型支原体的检测限为50 cfu,PCR检测限为5×103cfu,其检测灵敏度为PCR的100倍。所建立的检测方法对其他10种常见支原体、12种泌尿生殖道感染病原菌染色体及人类染色体的扩增均为阴性。结论本研究建立的real-time PCR方法可灵敏、特异的检测人型支原体,有望用于临床标本检测。
- 张慧芳张建中赵飞
- 关键词：人型支原体实时荧光聚合酶链反应
- 应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法被引量：20
- 2012年
- 目的应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)、黄热病毒(YellowFeverVirus,YFV)、西尼罗病毒(WestNileVirus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法。方法利用Primer Premier5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性。结果应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142 bp、293 bp、377 bp、630 bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5 000 PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105copies/μl、2.6×104copies/μl和1.37×104copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应。结论应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测。
- 徐焕洲平芮巾季汝武王琳杨鹏飞张丽萍岳启安胡孔新
- 关键词：多重RT-PCR日本脑炎病毒黄热病毒西尼罗病毒
- 非O157产志贺毒素大肠埃希菌分离株脉冲场凝胶电泳分析被引量：5
- 2013年
- 目的对国内不同宿主来源的非O157产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）分离株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析，以初步建立中国非O157STEC菌株的基础数据库，了解其分子流行病学特征。方法参照PulseNet非O157STEC的PFGE实验方法对76株非O157STEC分离株进行分析，并使用BioNumerics软件进行聚类。结果在PulseNet推荐的电泳参数和内切酶XbaI情况下，菌株酶切片段分布均匀，条带易于识别。76株非O157STEC分离株产生62种PFGE带型，初步聚类为A-M13个群，不同来源菌株的PFGE带型分布广泛，但均具有某些优势的PFGE聚类群。结论国内不同来源的非O157STEC呈高度多态性，PulseNet推荐的PFGE电泳参数和内切酶XbaI适用于中国非O157STEC菌株的分析。
- 金东赵爱兰白向宁孟琼于波袁雪娇熊衍文侯雪新李振军
- 关键词：脉冲场凝胶电泳分子分型
