国家自然科学基金(30200200)
- 作品数：10 被引量：17H指数：3
- 相关作者：相文华王晓钧沈荣显魏丽丽张晓燕更多>>
- 相关机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国疾病预防控制中心东北农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金科技部基础研究重大项目前期研究专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- EIAV减毒疫苗免疫后马外周血单个核细胞中IFN-γ的转录被引量：5
- 2006年
- 目的:探讨马传染性贫血病毒(Equineinfectiousa-nemiavirus,EIAV)驴白细胞减毒疫苗(DLV)免疫马后,外周血单个核细胞(PBMC)中IFN-γmRNA转录水平与免疫保护应答的关系,揭示DLV的免疫保护机制。方法:应用分子克隆及实时定量RT-PCR技术,建立马PBMC中IFN-γmRNA转录水平的定量检测方法,在不同时间点定期观察4组(疫苗免疫组、阴性对照组、强毒株阳性对照组及EIAV自然感染组)12匹马PBMC中IFN-γmRNA的转录水平及分布特征,同时监测体温变化等指标。疫苗株免疫动物8个月后,用EIAV强毒株攻击,观察攻击前后IFN-γmRNA转录水平的变化。结果:疫苗免疫马在免疫期内,PBMC中IFN-γmRNA转录的量显著高于阴性对照组及自然感染组(P<0.01)。免疫后用EIAV强毒株攻击,IFN-γ转录的量继续升高,4匹免疫马均获得完全保护;强毒株阳性对照组IFN-γmRNA转录的量随疾病的进展波动,发热期明显下降。结论:本研究首次证明,EIAV减毒疫苗可诱导马PBMC中IFN-γ基因高效转录,其转录水平与DLV的免疫保护密切相关。此结果在分子水平为阐明DLV的免疫保护机制提供了新的实验依据。
- 王盈张晓燕魏丽丽吴东来王晓钧相文华沈荣显邵一鸣
- 关键词：马传染性贫血病毒转录
- 马传染性贫血病毒LTR的研究进展被引量：2
- 2004年
- 马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)引起马属动物以贫血,持续感染,反复发热为特征的一种急性烈性传染病.与人免疫缺陷病毒(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属的重要成员,二者在基因组结构,复制方式和相似的蛋白种类及功能,传播方式和致病机理方面具有极高的相似性.近年来,随着HIV研究的展开带动了EIAV分子生物研究的发展,EIAV是慢病毒系统中结构最为精确的病毒,为研究人艾滋病提供了绝好的试验模型.
- 魏丽丽王晓钧王盈李景鹏相文华沈荣显
- 关键词：传染性贫血病毒LTR
- 马传染性贫血病毒弱毒株LTR点突变型嵌合感染性克隆的构建被引量：1
- 2007年
- 马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)长末端重复序列(Long terminal repeat,LTR)是基因组中高度变异区之一,EIAV LTR的变异对于指导病毒的复制和病毒致病性具有重要的生物学意义。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,由马传贫强毒至弱毒致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,以驴胎皮肤弱毒株疫苗全长感染性克隆pLGFD3-8为父本,选取LTR R区的TAR起始碱基,poly(A)附加位点,采用反向遗传操作对其位点进行PCR体外定点突变,将弱毒序列构建的逆向点突变型全基因克隆转染到驴胎皮肤细胞(FDD)并在FDD上传代,通过逆转录酶活性(RT)检测、RT-PCR方法及real-time RT PCR检测并验证其感染性。检测结果为构建的逆向点突变型感染性克隆在FDD上被拯救,其衍生病毒感染的FDD上出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性;电镜下可见大量典型的EIAV颗粒pLGFD-M点突变型嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8复制水平相似。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。
- 左咏梅吕晓玲赵立平李庆章郝艳红沈荣显相文华王晓钧
- 关键词：马传染性贫血病毒定点突变嵌合病毒
- 马传染性贫血病毒自然感染马LTR序列分析被引量：1
- 2005年
- 我国从 2 0世纪 70年代开始使用EIAV弱毒疫苗后 ,在全国范围内基本控制了马传贫的发生 ,我们从现地少数EIAV琼扩阳性马外周血中扩增并克隆了二株EIAV前病毒 5’LTR序列 ,并与国内外毒株 5’LTR序列进行了比较分析 ,发现中国EIAVLTR特有的特异性细胞转录因子结合基序 ,同时发现PEA2位点不是强毒特有的基序 ,在弱毒中亦发现该基序。
- 魏丽丽王晓钧王盈李景鹏相文华沈荣显
- 关键词：马传染性贫血病毒长末端重复序列
- Tat蛋白对马传染性贫血病毒长末端重复序列启动子活性的影响
- 2007年
- 将来源于马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株第25代和第118代病毒的LTR,白细胞弱毒(EIAV-DLA)的LTR,以及TAR起始碱基和/或poly(A)附加位点发生突变的驴胎皮肤细胞弱毒(EIAV-FDD)的LTR分别克隆到pCAT3-Basic质粒中,获得了6个重组质粒pCAT-25、pCAT-118、pCAT-FD、pCAT-G219A、pCAT-A294C和pCAT-G219A-A294C。同时用pcDNA3.1(+)构建了EIAV反式激活蛋白(Tat)基因的重组真核表达质粒pcTM7-D。将pcTM7-D分别与含有不同LTR的重组质粒共转染驴胎皮肤细胞,考察Tat对LTR启动子活性的增强作用。结果表明,在皮肤细胞中Tat蛋白可以特异性增强来源于皮肤细胞弱毒疫苗株LTR的启动子活性,而对白细胞源的LTR无明显增强作用;TAR起始位点和poly(A)的单碱基突变和联合突变对Tat的反式激活作用并无明显影响。
- 刘益民左咏梅周艳君王晓钧童光志相文华沈荣显
- 关键词：马传染性贫血病毒长末端重复序列启动子
- 马传染性贫血病毒基因非编码区LTR嵌合克隆的构建被引量：3
- 2005年
- 在已有全长感染性克隆pLGFD3 8 和pD70344 的基础上,根据马传贫弱毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,在LTR U3区选取特定的酶切位点对EIAV非编码区LTR基因进行了部分替换。将替换的全基因克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,用逆转录酶活性检测、RT PCR方法及Real time RT PCR验证其感染性。结果发现,其衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT PCR阳性。电镜下可见大量典型的EIAV颗粒。pLGFD9 12 嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3 8具有相似的复制水平,pLGFD9 12嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复制水平略高于FDD细胞。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。
- 魏丽丽王晓钧王盈粱华沈韬李景鹏张晓燕相文华邵一鸣沈荣显
- 关键词：马传染性贫血病毒嵌合病毒LTR
- 马传染性贫血病毒非编码区LTR嵌合克隆的生物学特性
- 2006年
- 将已构建的马传染性贫血病毒LTR强弱毒嵌合克隆衍生毒vLGFD9-12体内接种健康试验马,在150d观察期内,各组试验动物体症均未见异常。血液学分析发现,vLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒与亲本弱毒疫苗株的白细胞与血红蛋白含量总体上没有明显的规律性的变化。在动物外周血中均检测到一定的病毒RNA拷贝数,但拷贝数较低。二者在诱导EIAV特异性淋巴细胞增殖功能和特异性细胞毒性杀伤反应中,亦具有相似的变化趋势和效应。本项研究为进一步确定我国马传贫弱毒疫苗株毒力致弱及免疫保护的分子机制奠定了重要的分子生物学基础。
- 魏丽丽王晓钧耿庆华童骁粱华沈韬张晓燕相文华邵一鸣沈荣显
- 关键词：马传染性贫血病毒LTR
- 马传染性贫血病毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列变异被引量：4
- 2005年
- 有研究认为病毒基因组长末端重复序列LTR与病毒的毒力和复制能力直接相关。中国马传染性贫血弱毒疫苗是由一株高致病力毒株经体外白细胞传代而致弱的疫苗。经过体外超过110代传代后,病毒丧失了对马高致死性毒力并保持了良好的免疫原性。本文对传代过程中的不同代次病毒基因LTR进行了克隆和序列测定,发现传代过程中LTR发生了一系列明确的变异,一是转录起始位点在64代之前均以GGAC为特征,64代之后则表现为不规律的GAAC,AAAC,AGAC或GGTC;二是TAR起始碱基在59代之前多数为A,而64代之后均为G;三是在45代之后(55代除外),poly(A)附加位点一致表现为AA,这种一致的核苷酸变化均发生在毒力明显降低的代次,提示这些突变引起的位点或结构变化很可能与病毒毒力减弱有直接关系。
- 王晓钧魏丽丽范秀娟吕晓玲相文华张晓燕邵一鸣沈荣显
- 关键词：马传染性贫血病毒长末端重复序列
- 中国马传染性贫血病毒驴强毒株感染性分子克隆的构建被引量：4
- 2005年
- 马传染性贫血病毒(equineinfectiousanemiavirus,EIAV)驴强毒株DV是一株经过驴体传代获得的而具有超强毒力的毒株,对马和驴均可100%致死。用PCR方法分段扩增了DV其前病毒基因,将包含全基因片段的3个基因克隆以限制性内切酶消化后顺次连接克隆到pLG338上,命名为pD70344。将此克隆体外转染驴胎皮肤细胞和驴白细胞,连续盲传3代并以反转录酶活性测定,RT-PCR鉴定其病毒活性,透射电镜观察发现细胞培养物中存在大量典型病毒粒子,证明获得了1株具有感染性的EIAV病毒粒子,命名为pD70344V。经序列测定确认了本试验首次构建了1株完全来源于EIAV强毒基因的感染性分子克隆,将此克隆病毒接种驴,可以引起典型的马传贫症状并导致试验动物死亡。该分子克隆的建立为进一步考察病毒的毒力与基因的关系提供了良好的平台。
- 王晓钧魏丽丽相文华张晓燕吕晓玲赵立平朱远茂邵一鸣沈荣显
- 关键词：马传染性贫血病毒感染性分子克隆马传染性贫血病毒感染性分子克隆强毒株酶活性测定病毒基因限制性内切酶
- EIAV减毒疫苗诱导马外周血单个核细胞Th1型细胞因子的转录被引量：1
- 2007年
- 目的:探讨马传染性贫血病毒驴白细胞减毒疫苗免疫马后,外周血单个核细胞中Th1型细胞因子转录水平与免疫保护应答的关系,揭示DLV的免疫保护机制。方法:应用分子克隆及实时定量RT-PCR技术,建立了马PBMC中IFNγ-、IL-2、IL-12 mRNA转录水平的定量检测方法,定期观察4组(疫苗免疫组、阴性对照组、强毒株阳性对照组、自然感染组)12匹马外周血PBMC中细胞因子的转录水平及分布特征,同时监测体温变化等指标。疫苗株免疫动物8个月后,用EIAV强毒株攻击,观察攻击前后细胞因子转录水平的变化。结果:DLV免疫马,在免疫后3周外周血PBMC中IFN-γ、IL-2转录量显著高于阴性对照组及自然感染组(P<0.01);免疫后用EIAV强毒株攻击,IFNγ-、IL-2和IL-12转录的量明显升高,免疫马获得完全保护;强毒株攻击阳性对照马IFN-γ、IL-2转录量随疾病进展波动,发热期下降。结论:本研究首次证明EIAV减毒疫苗可诱导马外周血PBMC中IFN-γ、IL-2、IL-12基因高效转录,其转录水平与DLV的免疫保护密切相关,此结果在分子水平为阐明DLV的免疫保护机制提供了新的实验依据。
- 王盈张晓燕魏丽丽吴东来相文华王晓钧吕晓玲沈荣显邵一鸣
- 关键词：马传染性贫血病毒减毒疫苗细胞因子转录
