国家教育部博士点基金(20061117004)
- 作品数：20 被引量：74H指数：6
- 相关作者：李碧春倪黎纲余飞何先红田智泉更多>>
- 相关机构：扬州大学苏州大学江苏省农业科学院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金国家自然科学基金江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学自动化与计算机技术医药卫生更多>>
- 鸡精原干细胞定向诱导分化特性的研究被引量：3
- 2008年
- 取孵化18～20d的鸡胚睾丸，分离精原干细胞（SSCs），培养传代3次后，用特异性化学物质定向诱导分化，以研究鸡培养传代后SSCs保持多向分化的潜能。①用特异的化学物质地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C诱导鸡SSCs向成骨细胞分化，用Von Kossa＇s法、改良的钙钴法及免疫组化法进行成骨细胞鉴定；②用维甲酸（RA）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导SSCs向神经元样细胞分化，甲苯胺蓝特异染色和组织化学鉴定。③用地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导SSCs向脂肪细胞分化，特异性的油红O染色和脂肪细胞标志基因PPAR7检测。结果显示，SSCs被诱导15～21d后分化为成骨细胞，诱导形成率为80％；Von Kossa＇s染色细胞间布满黑色颗粒，具有矿化基质沉积；改良钙钴法碱性磷酸酶染色胞浆呈深棕色或深黑色，免疫组化染色细胞呈阳性。SSCs被诱导3～7d后分化为神经元样细胞，甲苯胺蓝染色阳性率为85％。SSCs被诱导7～21d后，分化成脂肪细胞，分化率为85％。诱导的脂肪细胞经特异性的油红O染色为阳性，并高表达脂肪细胞标志基因PPARγ。结论：在不同的诱导条件下，SSCs可被定向诱导分化为3种成体细胞，证明其培养传代后仍具有多向分化能力。
- 李碧春魏彩霞余飞何先红倪黎纲陈强王宵燕肖小君徐琪刘铁铮
- 关键词：精原干细胞成骨细胞神经元样细胞脂肪细胞分化
- 禽类Mx蛋白的研究进展被引量：1
- 2007年
- Mx蛋白在许多生物体内发现,具有广泛的抗病毒作用和GTP酶水解活性,是Ⅰ型干扰素诱导的蛋白,属于大分子GTP酶动态蛋白家族,其特征在N端有一个三联体GTP结构域和发动蛋白家族的结构特征序列,以及C端高度保守的亮氨酸拉链结构域。本文对Mx蛋白的发现、结构、表达调控、抗病毒活性等作一简要综述,着重介绍了禽类Mx蛋白的研究进展,并对禽类Mx蛋白研究的应用进行了展望。
- 倪黎纲李碧春包文斌
- 关键词：MX蛋白禽类抗病毒活性
- 鸡Mx基因2032位点单核苷酸多态性研究被引量：5
- 2009年
- 研究采用错配PCIK-IKFLP的方法对15个品种鸡的Mx基因进行筛查，旨在探索不同鸡品种Mx cDNA第2032位点抗病基因A与易感等位基因G的多态性，为生产转基因鸡的可行性提供理论基础。结果表明：15个鸡品种Mx基因的2032位点存在A、G2个等位基因，AA、AG、GG3种基因型，其中鹿苑鸡、狼山鸡、斗鸡未发现AA型个体，茶花鸡、红色原鸡未发现GG个体；携带帆抗性基因A和易感基因G的比例分别是0．350、0．650：抗性等住基因A的检测比例为0．034～0．984。红色原鸡的抗性等位基因A基因频率（0．984）高于地方鸡种的抗性等住基因A的基因频率（0．321）；地方鸡种中的观赏型、蛋肉兼用型、肉用型、蛋用型鸡种的抗性等位基因A的基因频率分别为0．221、0．297、0．425、0．462。χ^2适合性检验表明，15个品种的鸡群均处于Hardy—Weinberg平衡状态。
- 吴晓伟范敏其倪黎纲程旭梅陈强田智泉李碧春
- 关键词：MX基因抗性基因单核苷酸多态性
- 鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达
- 2010年
- 为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。
- 田智泉杨海燕徐琪孙敏许峰任丽伟丁爱军秦玉蓉李碧春
- 关键词：毕赤酵母MX蛋白
- 鸡胚胎干细胞单细胞克隆制备方法的比较
- 2008年
- 提取鸡X期胚盘细胞,体外培养传至第3代,采用口吸管法、细胞稀释法及克隆环法将细胞集落分离成单个细胞,并将其接种至96孔板上,每孔1个细胞,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物,探讨鸡胚胎干细胞单细胞克隆制备的实际操作的可行性,并对其生物学特性进行鉴定。结果表明:口吸管法、克隆环法、细胞稀释法克隆率分别为0、1.0%、4.2%。3种方法相比较,细胞稀释法具有操作简单易行、实验时间短、对细胞伤害小等优点,经碱性磷酸酶活性和阶段特异性表面抗原1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖且不分化。
- 何先红倪黎纲余飞李碧春
- 关键词：胚胎干细胞
- 体外重组神经氨酸酶的表达及其亚细胞定位研究
- 2011年
- 研究神经氨酸酶(NA)基因在体外培养NIH-3T3细胞中的表达定位。实验构建了真核表达载体pcDNA3.0/EGFP-NA与pcDNA3.0-NA,采用聚乙烯亚胺介导基因转染法,分别转染NIH-3T3细胞,转染48 h后在荧光倒置显微镜下观察,并分别用RT-PCR与间接免疫荧光(IFA)进一步检测。结果表明:成功构建了EGFP-NA融合蛋白的表达载体;RT-PCR检测到EGFP-NA融合蛋白的表达;NIH-3T3细胞EGFP标记观察显示绿色荧光分布在胞质近胞膜,细胞核内无绿色荧光;间接免疫荧光鉴定显示,绿色荧光分布在细胞膜内外,表达的重组NA蛋白定位在细胞膜上。
- 任丽伟丁爱军傅德智李碧春
- 关键词：绿色荧光蛋白重组质粒
- 家鸡Mx基因多态性及其诱变修饰的研究被引量：7
- 2008年
- 研究采用错配PCR-RFLP的方法对家鸡14个品种的Mx基因变异性分布进行了探索;并利用PCR突变技术将Mx基因全长cDNA第2032位碱基由G突变为A(即631位氨基酸的改变),并将突变的Mx基因插入真核表达载体pcDNA3.0,转染COS-Ⅰ细胞,进行RT-PCR与间接免疫荧光(IFA)鉴定,研究结果显示,14个品种Mx基因的2032位点存在2个等位基因(A、G),3种基因型(AA、AG、GG),其中鹿苑鸡、狼山鸡、斗鸡未发现AA型个体,茶花鸡未发现GG个体;并成功对Mx基因进行PCR诱变修饰和构建了能够表达鸡Mx基因的重组真核表达载体,为其体内外表达及生物学活性的进一步研究奠定了基础。
- 李碧春吴晓伟倪黎纲刘铁铮
- 关键词：MX基因抗病性限制性片段长度多态性
- 体内外精原干细胞介导大群生产转基因鸡被引量：8
- 2008年
- 本研究以重组的绿色荧光蛋白基因为标记，采用公鸡睾丸内转染精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）和体外转染SSCs再移植的方法，探索家禽转基因新方法．同时比较了公鸡接受不同剂量外源基因的转基因效率．结果显示：（i）接受外源基因剂量分别为50，100，150和200μg／mL时，48h后睾丸细胞显示绿色荧光的比率分别为4．0％，8．7％，10．2％和13．6％，差异显著（P〈0．05）．睾丸内注射外源基因第25天后，随着时间的增长，精子表达绿色荧光的百分率逐渐提高，到第70天后表达率达到高峰，且趋于稳定，4个剂量组分别为12．7％，12．8％，15．9％和19．1％．差异显著（P〈0．05）；（ii）第70天的睾丸冰冻切片观察，曲精细管周边均有荧光表达；（iii）F1代中，56．2％（254／452）的胚盘表达绿色荧光．活鸡血样PCR检测56．5％（13／23）为阳性，Southern blot检测证明外源基因已整合到鸡基因组；F2代中，53．2％（275／517）的胚盘表达绿色荧光．活鸡血样PCR检测52．9％（9／17）为阳性；（iv）F，代和F2代鸡心、肝、肾和肌肉等组织冰冻切片观察和PCR检测，绿色荧光阳性率在50．0％～66．7％之间；（v）体外SSCs转染外源基因后移植，可在受体公鸡睾丸中生长发育，正常产生精子．后代中，12．5％（8／64）的胚盘表达绿色荧光，活鸡血样PCR检测11．1％（2／18）为阳性．结果证明精原干细胞介导转基因是一种简单、高效、可大群体生产转基因鸡的有效途径．
- 李碧春孙国波孙怀昌徐琪高波周冠月赵文明吴信生包文斌余飞陈国宏
- 关键词：绿色荧光蛋白基因
- 鸡抗病毒Mx蛋白修饰及其真核表达载体的构建被引量：8
- 2008年
- 利用高保真RT-PCR的方法从Poly(I).Poly(C)诱导的鸡成纤维细胞总RNA中扩增出鸡全长MxcD-NA,扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上,利用PCR突变技术将其第2 032位的碱基由G突变为A,经克隆测序证实突变成功后,将已突变的Mx基因插入真核表达载体,通过PCR、酶切鉴定插入片段正确,提取质粒转染COS-Ⅰ细胞进行RT-PCR鉴定。结果表明:正确克隆了鸡Mx基因,并成功对该基因进行PCR诱变修饰,构建了能够表达鸡Mx基因的重组真核表达载体,为Mx基因体内外表达及生物学活性的进一步研究奠定了基础。
- 倪黎纲何先红余飞李碧春高波谢飞程旭梅吴晓伟
- 关键词：MX蛋白真核表达载体
- 利用“转基因精子”生产大群转基因家禽被引量：1
- 2008年
- 由于家禽特殊的生理和生殖器官解剖学特点,一些适用于哺乳动物的转基因方法在家禽上并不合适,文章作者对通过制造转基因精子生产转基因家禽的新技术进行探索,为生物技术领域转基因方法的研究提供了新思路。
- 李碧春程旭梅
- 关键词：原始生殖细胞显微注射法大群精子体外转染慢病毒载体
