国家高技术研究发展计划(2007AA10Z437)
- 作品数：13 被引量：78H指数：6
- 相关作者：孙远明王弘雷红涛沈玉栋刘细霞更多>>
- 相关机构：华南农业大学广州军区广州总医院广州城市职业学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学农业科学理学更多>>
- 恩诺沙星时间分辨免疫分析方法的建立
- 采用时间分辨荧光技术建立恩诺沙星(EF)间接竞争免疫检测法。以EF-OVA作为包被原,游离EF与EF包被原(EF-OVA)共同竞争限量的EF抗体,用铕标二抗作为示踪物。该方法的检测限为0.01ng/mL,IC为0.07n...
- 李丽华杨金易沈玉栋孙远明
- 关键词：恩诺沙星
- 沙丁胺醇单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立被引量：10
- 2010年
- 制备抗沙丁胺醇单克隆抗体,鉴定其特异性并建立间接竞争ELISA检测方法。以合成的沙丁胺醇完全抗原免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选克隆得到稳定分泌抗沙丁胺醇抗体的单克隆杂交瘤细胞,命名为4E4和3A2。经鉴定,两个抗体亚类都为IgG1,其腹水纯化后效价分别达到2.56×10^5和1.28×10^5。以效价高且特异性较好的4E4细胞株获得的抗体建立间接竞争ELISA方法,经条件优化后得到标准曲线,检测范围为4.76-84.99ng/mL,IC50为20.12ng/mL,检测限为3.25ng/mL,与克伦特罗交叉反应率为253.62%,与其它结构类似物没有明显交叉反应。本研究制备的单克隆抗体和建立的间接ELISA方法,可用于开发同时检测沙丁胺醇和克伦特罗的试剂盒。
- 彭述辉袁利鹏孙远明雷红涛王保玲徐振林庞杰
- 关键词：沙丁胺醇单克隆抗体间接ELISA
- 二甲氧基硫代磷酸酯类农药多残留免疫分析方法研究被引量：12
- 2010年
- 以二甲氧基硫代磷酸酯类农药为目标,设计合成了系列半抗原及抗原,制备了4种宽谱特异性抗体。研究结果表明,含不饱和烷烃手臂的半抗原所制备的抗体宽谱特异性优于含酰胺键手臂的半抗原所制备的抗体。采用目标待测物的特征"次级结构"作为包被半抗原可显著提高ELISA检测灵敏度。经条件优化建立的最佳间接竞争ELISA多残留检测方法可同时检测8种常用高毒农药,其检出限(LOD)在2.6～104μg/kg之间,符合相关限量标准要求。生菜样品药物添加平均回收率为73.9%～121.4%;平均相对标准偏差为10.6%～18.4%。菜心样品药物添加平均回收率为80.4%～121.2%;平均相对标准偏差为13.5%～24.4%。方法精密度均达到气相色谱法的检测水平。
- 李永祥徐振林王弘雷红涛孙远明沈丹杨金易沈玉栋
- 关键词：有机磷农药多残留检测酶联免疫吸附分析
- 抗克伦特罗单链抗体基因构建及蛋白结构模拟被引量：2
- 2009年
- 目的:构建抗克伦特罗单链抗体(scFv)基因cbl,进行蛋白质结构模拟并对其理化特性进行分析。方法:采用重叠延伸PCR方法,以能特异性分泌抗克伦特罗mAb的杂交瘤细胞株5D1为原料,构建抗克伦特罗scFv基因cbl,进行测序,采用生物信息软件对氨基酸序列推导并进行结构预测,同时对理化性质进行分析。结果:抗克伦特罗scFv基因cbl全长720bp,对应225个氨基酸,单链抗体分子量约为25826.6,等电点预测值8.78,为碱性蛋白质;二级结构显示抗克伦特罗单链抗体含α螺旋20处,β折叠99处,β转角28处,随机卷曲93处。cbl三级结构建模显示重链(VH)和轻链(VL)形成一个疏水的"口袋",Linker游离于此结构之外,符合scFv的结构特点,明显具有抗原结合位点的空间构象,理论上应该具有良好的抗原结合活性。结论:构建一个抗克伦特罗scFv基因cbl,应用信息学技术所获得的预测和分析结果为抗克伦特罗单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究提供信息。
- 王弘刘细霞潘科雷红涛沈玉栋孙远明
- 关键词：克伦特罗单链抗体
- 硫代磷酸二乙酯类农药半抗原设计及抗体识别特性被引量：16
- 2009年
- 通过分析硫代磷酸二乙酯类农药的结构特点,设计并合成了系列半抗原;采用活泼酯法将半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了系列免疫原和包被原;通过免疫新西兰大白兔获得了相应抗硫代磷酸二乙酯类农药的类特异性抗体.建立检测硫代磷酸二乙酯类农药的间接竞争酶联免疫分析(ELISA)方法,分析探讨了免疫半抗原结构对抗体特性的影响,并阐述了包被半抗原结构对ELISA灵敏度的影响规律.结果表明,手臂取代位置在苯环对位且手臂较短的免疫原具有较好的免疫效果,同时异源包被可以显著提高ELISA方法的灵敏度.由抗体PAb-H1和包被原H6-OVA建立的间接竞争ELISA方法可以同时检测7个广泛使用的有机磷农药,其半抑制浓度(IC50)分别为蝇毒磷(0.013 mg/L)、对硫磷(0.348 mg/L)、喹硫磷(0.022 mg/L)、三唑磷(0.035 mg/L)、甲拌磷(0.751 mg/L)、除线磷(0.850 mg/L)及辛硫磷(1.301mg/L),最低检测限符合国内外相关有机磷药物最大允许残留限量标准(MRLS)的检测要求.
- 谢桂勉孙远明徐振林李永祥雷红涛王弘沈玉栋
- 关键词：有机磷农药酶联免疫分析
- 抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定被引量：5
- 2008年
- 为构建克伦特罗(Clenbuterol,CBL)单链抗体(scFv)表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E-CBL质粒为模板,扩增CBL的scFv基因,与pPICZαA载体重组,然后以重组质粒pPICZαA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6个组氨酸(6×His)片段,再与载体pBV220连接,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片段的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段,与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37kD,能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为4.55ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达,为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。
- 王弘梁艳杨金易刘细霞张宏斌雷红涛沈玉栋孙远明
- 关键词：克伦特罗原核表达
- 抗呋喃它酮代谢物的衍生物噬菌体单链抗体库的构建
- 2010年
- 目的:构建抗呋喃它酮代谢物(AMOZ)的衍生物噬菌体单链抗体库。方法:从分泌抗AMOZ的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(BC3-E8)中提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,设计通用简并引物,PCR扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。经重叠延伸PCR(SOE-PCR),将VH和VL基因用编码(G1y4Ser)3的linker随机拼接成单链抗体(scFv)基因,然后将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)TG1感受态细胞,经辅助噬菌体M13K07超感染,建立噬菌体单链抗体库。随机挑取10个阳性克隆,经PCR和双酶切鉴定,并测序。登陆DNAMAN软件对序列进行分析、比对。结果:成功扩增VH、VL及scFv基因,并得到库容为1.2×106的噬菌体抗体库,噬菌体的滴度为2.0×1010PFU,PCR鉴定及双酶切鉴定文库重组率较高,软件对序列比对结果显示,scFv基因全长序列之间差异为8.38%,VH序列差异为3.68%,VL序列差异为14.34%,且序列差异多集中在CDR抗原结合区域对应的核酸序列上。结论:已构建抗呋喃它酮代谢物的衍生物噬菌体单链抗体库,为进一步富集筛选并表达抗AMOZ的衍生物的单链抗体提供参考。
- 罗翠红王弘刘细霞沈玉栋孙远明黄佳佳张宏斌
- 关键词：单链抗体噬菌体展示
- 电子束辐照在食品中兽药残留降解的应用被引量：13
- 2011年
- 作为食品质量与安全控制领域的技术之一,电子束辐照技术已经广泛应用于食品的杀菌与保鲜。近年来,利用电子束辐照技术降解食品中兽药残留逐渐成为研究热点。本文对电子束辐照技术的工作原理、特点及其在食品中兽药残留降解方面的应用现状与前景进行综述。
- 黄佳佳徐振林罗翠红王弘雷红涛孙远明
- 关键词：电子束辐照兽药残留
- 原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究被引量：2
- 2009年
- 目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鉴定重组抗体特性。方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体。以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性。超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白。通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western blotting和间接竞争ELISA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定。结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%。以1mol/L尿素洗涤包涵体,6mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%。Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应。间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应。结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础。
- 王弘刘细霞梁艳张宏斌孙远明陈舒迟
- 关键词：克伦特罗单链抗体原核表达纯化
- 抗克伦特罗单链抗体基因工程菌株发酵条件的研究被引量：1
- 2009年
- 重组大肠杆菌BL21携带抗克伦特罗单链抗体(scFv)基因,研究了不同培养基、诱导时期、诱导时间、初始pH以及装液量对重组抗体表达量的影响,并对重组质粒稳定性进行研究。结果表明,在初始pH为7.2、装液量为25mL/250mL的LB培养基中,30℃培养菌体生长至A600nm为0.8时,42℃诱导表达6h,scFv表达量可达33.7%。工程菌在无选择压力条件下连续传代120代,保持稳定,100%的菌株携带重组质粒且经诱导后均有重组抗体的表达。
- 王弘梁艳刘细霞杨金易雷红涛沈玉栋孙远明
- 关键词：克伦特罗单链抗体工程菌
