北京市科委科技计划项目(954024800)
- 作品数：5 被引量：18H指数：2
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- 相关机构：首都医科大学肯塔基大学更多>>
- 发文基金：北京市科委科技计划项目北京市教委资助项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达被引量：1
- 2008年
- 目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。
- 王雅梅李慎涛温铭杰孙丽翠司杨闫豫东祁雅慧
- 关键词：血管内皮细胞生长因子真核表达载体基因表达
- 过表达bFGF促进大鼠急性缺血心肌的毛细血管生成被引量：2
- 2011年
- 研究过表达人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)在大鼠急性心肌缺血模型中的表达及其对心肌血管再生的影响.将含人bFGF质粒pcDNA/b转染人脐带静脉内皮细胞(HUVEC),进行MTT检测.pcDNA/b转染人肾细胞293细胞系,进行G418稳定筛选,Western印迹检测.建立大鼠急性心肌梗死模型,分别将生理盐水、空质粒pcDNA3.1(+)和pcDNA/b分3点注射于梗死交界处心肌内4周后取材,做常规HE染色和Masson染色,测量各组微血管数量和梗死面积.经免疫组织化学染色鉴定和电镜观察,过表达外源bFGF可以促进HUVEC(细胞)生长;pcDNA/b能在293细胞中高效表达外源bFGF基因.pcDNA/b注射组梗死交界处可见大量新生血管,毛细血管总数明显大于对照组,梗死面积明显小于对照组.pcDNA/b组在梗死交界区有bFGF阳性表达.电镜观察显示,在梗死交界处心肌细胞间有毛细血管增生,分化成2个血管腔.本实验证明,过表达bFGF具有促进大鼠急性缺血心肌的毛细血管生成的作用,为bFGF基因治疗缺血性心肌病的研究提供实验基础.
- 王雅梅刘冰孙丽翠祁雅慧司杨闫豫东郑少鹏
- 关键词：碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体基因过表达
- VEGF重组质粒pcDNA/V的构建及其在大鼠急性心肌缺血模型中的表达被引量：6
- 2006年
- 构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)真核表达载体,并研究其在细胞水平和大鼠急性心肌梗死动物模型中的表达。利用RT-PCR方法,从人扁桃体组织中扩增人VEGF165基因,构建真核表达载体pcDNA/V。应用脂质体介导的基因转移技术,将pcDNA/V转染至人胚肾细胞(293细胞)中,经G418筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆。ELISA、Westernblot检测证实重组质粒pcDNA/V能在293细胞中高效表达外源VEGF基因,鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验证实表达产物具有促血管生成的活性。进一步的体内表达研究,建立大鼠急性心肌梗死模型,将重组质粒pcDNA/V、空质粒pcDNA3.1(+)分三点注射于梗死交界处心肌内,四周后取材。经免疫组化染色检测,pcDNA/V组在梗死交界区有VEGF阳性表达;电镜观察显示,pcDNA/V组在梗死交界处心肌细胞间有大量毛细血管内皮细胞增生。实验结果表明成功克隆了人VEGF165基因,构建了其真核表达载体。体内、外表达研究证实重组质粒的表达产物具有促血管生成的生物学活性,为VEGF基因治疗缺血性心肌病的研究提供实验基础。
- 王雅梅刘冰孙丽翠闫豫东司杨祁雅慧
- 关键词：血管内皮细胞生长因子真核表达载体
- 利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子被引量：2
- 2007年
- 目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性。方法将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性。结果重组Bacmid/bFGFDNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8。重组病毒在感染后48h开始出现一相对分子质量为23000大小的特异带,感染后72h蛋白量明显增加,96h蛋白量达到最大,120h蛋白量开始减少。在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带。Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应。MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖。结论利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白。
- 王雅梅孙丽翠闫豫东司杨张静宜祁雅慧
- 关键词：人碱性成纤维细胞生长因子昆虫细胞基因表达
- 人血管内皮生长因子基因的克隆、表达及生物活性分析被引量：7
- 2004年
- 目的 克隆人血管内皮细胞生长因子1 6 5(VEGF1 6 5)基因 ,构建真核表达载体 ,观察其对脐静脉内皮细胞的增殖作用和血管新生的影响。 方法 利用RT PCR方法 ,从人扁桃体组织中扩增人VEGF1 6 5cDNA完整编码区 ,并构建成pcDNA 3 1(+) VEGF1 6 5(简称pcDNA V)重组体 ;应用脂质体介导的基因转移技术将构建的真核表达载体pcDNA V体外转染至人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) ,MTT法检测其对内皮细胞增殖的影响。建立家兔下肢缺血模型 ,注射重组质粒pcDNA V ,pcDNA 3 1(+)空质粒作对照 ,选取不同时间点 ,行血管造影。 结果 构建的真核表达载体pcDNA V的酶切电泳分析和测序表明结果正确。pcDNA V转染HUVEC能明显促进内皮细胞的分裂增殖。血管造影显示 ,术后基因治疗组远端动脉充盈早于对照组 ,新生血管数目也明显多于同时期对照组。 结论 成功克隆了人VEGF1 6 5基因 ,构建了其真核表达载体。体内外生物学活性研究证实 ,重组质粒的表达产物具有刺激HUVEC增殖和促进缺血肢体侧枝循环建立的功能。
- 祁雅慧王雅梅孙丽翠滕旭闫豫东司杨武文琦邴国英
- 关键词：血管内皮细胞生长因子基因克隆基因表达
