国家自然科学基金(81172980)
- 作品数：7 被引量：20H指数：2
- 相关作者：于长明房婷刘树玲陈薇迟象阳更多>>
- 相关机构：军事医学科学院解放军第302医院中国人民解放军更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家杰出青年科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及体外亲和筛选被引量：3
- 2013年
- 目的构建人破伤风免疫噬菌体单链抗体库,筛选抗破伤风毒素重链C端(TeNT-Hc)的特异性单链抗体(scFv)。方法利用RT-PCR从5名破伤风抗体滴度较高的健康献浆员外周血淋巴细胞中获得全套人破伤风抗体VH和VL基因,经过重叠PCR将VH和VL基因连接获得scFv片段。将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转化大肠TG1感受态菌,获得抗体库。以TeNT-Hc为抗原对抗体库进行3轮筛选,获得特异性人源性抗TeNT-Hc单链抗体。scFv由pET32a(+)表达载体表达,产物包涵体采用HisTrap FF预装柱纯化并透析复性。采用非竞争酶免疫实验法测定scFv亲和常数(affinity constant,KD值)。检测scFv抑制TeNT-Hc与神经节苷脂GT1b结合的体外中和活性,计算抑制率。结果构建库容量为1×108的人破伤风免疫噬菌体单链抗体库,经过筛选获得3株特异性较好的人源性抗TeNT-Hc单链抗体。原核表达结果显示,3株scFv均以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的40%～45%。包涵体经洗涤、纯化和复性后,scFv均保持了与TeNT-Hc的特异结合活性,1 L培养物经纯化后可获得4～6 mg scFv蛋白。亲和力测定结果,27G、22D和S-4-7H-scFv的KD值分别为(1.25×10-7),(2.31×10-7)和(1.97×10-7)mol/L。3株抗体对TeNT-Hc与神经节苷脂GT1b结合的抑制率分别为64.5%,58.6%和51.5%。结论人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及具有体外中和活性的特异性抗TeNT-Hc单链抗体的获得,为人破伤风基因工程中和抗体的制备奠定了良好基础。
- 王晗于蕊张晓鹏任军谢娜樊红艳张金龙房婷于长明陈薇
- 关键词：破伤风破伤风毒素单链抗体逆转录聚合酶链反应细菌噬菌体
- 人破伤风基因工程中和抗体的研究进展被引量：1
- 2013年
- 破伤风是一种既古老又年轻的疾病。2300年前，希腊医生希波克拉底首次描述了外伤引起破伤风感染病例。我国医书《五十二病方》、《黄帝内经》等均对破伤风有过描述。破伤风疫苗及抗毒素等的成功研制虽然大大降低了破伤风感染病死率，但作为世界上已知最毒的毒素之一，自然灾害、生物恐怖战剂以及治疗困难等使破伤风仍然在一些国家和地区威胁着人们的健康。目前破伤风的致病机制、重组疫苗及抗体的研究是破伤风研究的主要领域，尤其是人破伤风基因工程中和抗体的研制将为破伤风感染提供更加安全、廉价的治疗手段。目前还没有一种人破伤风中和抗体药物获得FDA认证。本文从破伤风感染的威胁、致病机制、中和抗体治疗、抗原表位研究和抗体水平检测等方面，对破伤风中和抗体的研究进行概述。
- 王晗于蕊于长明陈薇
- 关键词：破伤风感染中和抗体基因工程《五十二病方》抗体水平检测希波克拉底
- 抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的制备及筛选被引量：1
- 2013年
- 目的获得能够结合细胞表面前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)的抗人PSCA单克隆抗体。方法以重组人PSCA蛋白为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗人PSCA单克隆抗体,并进行ELISA、Western印迹、流式细胞术等实验筛选。结果获得6株抗人PSCA单克隆抗体,经过筛选最终得到3株能够结合细胞表面PSCA的单克隆抗体。结论获得具有结合细胞表面PSCA活性的单克隆抗体,为进一步研究和应用奠定了基础。
- 樊红艳刘树玲张晓鹏易绍琼房婷董磊于长明
- 关键词：前列腺肿瘤肿瘤干细胞
- 应用噬菌体随机肽库技术筛选鼠疫耶尔森菌F1抗原中和性表位
- 2015年
- 目的:筛选鼠疫耶尔森菌F1抗原的中和性表位,构建基于鞭毛蛋白佐剂的重组表位疫苗。方法:利用鼠疫菌F1抗原的中和抗体F2H5筛选噬菌体随机12肽库,对得到的阳性克隆采用ELISA进行特异性鉴定,采用竞争抑制ELISA确定具有竞争性的噬菌体单克隆并对其DNA测序,重组表达并纯化获得肽序列与截短型鞭毛蛋白Fli Cdel的融合蛋白,并通过Western印迹和ELISA鉴定重组蛋白与F2H5的结合。结果:获得了2株能够与F1抗原竞争结合F2H5的噬菌体单克隆12-1和12-14,其中12-14的竞争能力较强;通过序列比对,并没有发现这2株噬菌体克隆的插入肽序列与F1抗原序列存在一致性,但这2个插入肽序列与Fli Cdel的重组蛋白在Western印迹和ELISA结果中均显示出能够被抗F1的单克隆抗体识别。结论:F1中和性抗体筛选出的肽序列与截短的鞭毛蛋白融合表达后能够被F2H5特异性识别,为进一步对重组表位抗原进行免疫保护评价奠定了基础。
- 尹可欣迟象阳任军房婷刘树玲刘炬杨秀旭李建民于长明
- 关键词：鼠疫耶尔森菌F1抗原噬菌体随机肽库表位
- 单个B细胞抗体制备技术及应用被引量：14
- 2012年
- 单克隆抗体是现代生命科学研究的重要工具,为许多领域的发展作出了不可估量的贡献。随着PCR技术和单克隆抗体技术的发展和成熟,单个B细胞抗体制备技术迅速兴起。该技术能够对单个的抗原特异性B细胞进行抗体基因的体外克隆和表达,保证了轻重链可变区的天然配对,相较于传统的抗体制备技术具有效率高、全人源、基因多样性更丰富等优势。单个B细胞抗体制备技术已成为制备全人抗体的热门方法,同时也促进了包括抗体发生成熟、疫苗保护机制、疫苗开发、肿瘤及自身免疫疾病等免疫学相关研究。文中就单个B细胞抗体制备技术的过程及应用作简要综述。
- 迟象阳于长明陈薇
- 关键词：单克隆抗体免疫球蛋白基因逆转录PCR
- 抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体可变区基因的5'RACE扩增及序列分析
- 2013年
- 目的:克隆并分析抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体轻链和重链的可变区基因。方法:从分泌抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取总RNA,根据小鼠IgG恒定区序列设计特异性引物,通过5′RACE法扩增其轻链和重链的可变区基因,克隆入pMD18-T载体,测序并分析其可变区序列。结果:3株抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的重链可变区基因序列全长均为423 bp,编码141个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长均为393 bp,编码131个氨基酸残基;在GenBank中对氨基酸序列进行比对分析,均符合小鼠IgG可变区基因的特征;根据Kabat法则对3株抗体轻链和重链可变区氨基酸序列进行分析,确定了3个抗原互补决定区、4个框架区和前导肽。结论:通过5'RACE法得到了3株抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构、人源化改造奠定了基础。
- 樊红艳刘树玲房婷杨秀旭于长明
- 关键词：单克隆抗体
- 利用转基因小鼠筛选全人源炭疽致死因子中和抗体被引量：2
- 2016年
- 炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的严重威胁人类健康的传染病。炭疽毒素包括3种蛋白质成分:保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)。PA与LF形成致死毒素(LT),与EF形成水肿毒素(ET)。由于致死毒素(LT)在感染者损伤及死亡中发挥主要作用,因此在炭疽感染晚期单纯使用抗生素治疗难以发挥疗效,治疗性中和抗体成为目前最有效的炭疽治疗药物。目前国外获得的炭疽毒素抗体多为炭疽PA抗体,美国FDA已批准瑞西巴库(人源PA单抗)用于吸入性炭疽的治疗。一旦炭疽芽孢杆菌被人为改构或PA中和表位发生突变,针对PA单一表位的抗体将可能失效,因此针对LF的抗体将成为炭疽治疗的有效补充。目前国外已有的LF抗体多为鼠源抗体和嵌合抗体,而全人源抗体可以避免鼠源抗体免疫原性高等缺点。本研究首先用LF抗原免疫人抗体转基因小鼠,利用流式细胞仪从小鼠脾淋巴细胞中分选抗原特异的记忆B细胞,通过单细胞PCR方法快速获得两株具有结合活性的抗LF单抗1D7和2B9。瞬时转染Expi 293F细胞制备抗体,通过毒素中和实验(TNA)发现1D7和2B9在细胞模型中均显示较好的中和活性,并且与PA单抗联合使用时,表现出较好的协同作用。总之,本文利用转基因小鼠、流式分选技术和单细胞PCR技术的优势,快速筛选到全人源LF抗体,为快速筛选全人源单克隆抗体开辟了新的思路与方法。
- 王潇霖迟象阳刘炬刘威岑刘树玲邱顺芳温中华范鹏飞刘坤宋小红付玲张军于长明
- 关键词：转基因小鼠
