国家自然科学基金(30670068)
- 作品数：12 被引量：17H指数：2
- 相关作者：张部昌黄训端赵皓袁华张书祥更多>>
- 相关机构：安徽大学军事医学科学院安徽文达信息技术职业学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金安徽省高校省级自然科学研究项目安徽省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：生物学化学工程医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 红色糖多孢菌M合成3-脱氧-3-羰基-赤酮酸内酯B的限速因子研究
- 2010年
- 目的探讨红色糖多孢菌KR6基因突变体生物合成3-脱氧-3羰基-赤酮酸内酯B(DOEB)产量显著降低的原因。方法以KR6基因突变体M菌株为研究对象,采用相对实时荧光定量RT-PCR技术、抗原-抗体检测技术和高分辨LC-MS分析技术等,分别从基因的转录水平、翻译水平以及聚酮化合物水平等层面研究了DOEB的生物合成量。结果红色糖多孢菌M菌株与出发菌株A226相比,两者聚酮合酶(PKS)基因簇在转录水平和翻译水平上的表达差异均非造成DOEB产量降低的限速因子;而DOEB的前体转化能力却大幅度降低,因此,DOEB合酶的活力降低是造成生物合成DOEB产量降低的关键因素。结论 DOEB合酶的活力是生物合成DOEB的限速因子,本研究为进一步探讨利用基因工程途径提高新酮内酯类化合物产量奠定了基础。
- 马树梅黄训端王永中刘道琴刘惠曹诚陈惠鹏张部昌
- 红色糖多孢菌染色体基因快速失活技术研究及应用被引量：2
- 2009年
- 目的:研究红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术。方法:以Thio抗性基因(tsr)作为筛选标记,在其上下游分别连接失活目的基因两侧同源片段,利用PEG介导原生质体转化将线性DNA同源片段转入红色糖多孢菌,通过tsr基因两侧同源片段与染色体同时重组,将目的基因敲除或失活。结果:tsr基因两侧同源片段长度与红色糖多孢菌染色体同源重组效率密切相关,同源片段长度在500 bp左右时,线性片段与染色体有效重组率很低,而同源片段长度超过1000 bp时,可获得有效的基因失活突变菌株。通过这种技术构建的红色糖多孢菌ΔbldD基因突变体,合成红霉素产量显著降低,说明bldD参与红霉素合成基因调控。结论:红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术,对于分析红色糖多孢菌基因功能具有重要作用。
- 刘惠黄训端刘道琴赵玮樊伟韩姝张部昌
- 关键词：红色糖多孢菌同源重组
- 红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ突变体的构建及产物分析被引量：1
- 2010年
- 目的构建红色糖多孢菌糖基转移酶EryCⅢ失活突变体,为探索红霉素糖基结构修饰和合成新型红霉素衍生物打下基础。方法通过PCR扩增方法将eryCⅢ基因缺失130bp后,克隆至同源重组型质粒pWHM3上,构建pWHM3-ΔeryCⅢ,将其导入红色糖多孢菌A226中。经过两次同源重组,筛选出1株缺失EryCⅢ酶活性的红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ突变体。使用抑菌实验、薄层层析和质谱对其发酵产物进行分析,并通过回补实验进一步验证。结果与结论对红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ染色体序列测定表明,eryCⅢ基因相应位点缺失130bp,突变菌株发酵产物对枯草芽孢杆菌无抑制作用,薄层和质谱结果表明突变菌株积累3-L-mycarose红霉内酯B(MEB),而并没有发现红霉素产物。回补验证发现eryCⅢ基因导入A226-ΔeryCⅢ使得其恢复了红霉素合成能力。所构建的红色糖多孢菌EryCⅢ失活突变体A226-ΔeryCⅢ,为探讨组合合成红霉素衍生物奠定基础。
- 许晓娟黄训端赵玮郭金华陈惠鹏曹诚张部昌
- 关键词：红色糖多孢菌糖基转移酶同源重组红霉素
- bldD基因过量表达对红色糖多孢菌红霉素产量及孢子形成的影响被引量：5
- 2010年
- 目的通过增加红色糖多孢菌调控基因bldD拷贝,获得红霉素高产菌株,并探讨bldD基因过量表达对红色糖多孢菌形态分化的影响。方法以红色糖多孢菌A226为出发菌株,通过染色体同源重组方法获得红色糖多孢菌A226bldD基因失活突变菌株A226-△bldD。将bldD基因表达质粒pZMW-bldD分别导入突变株A226-△bldD及出发菌株A226中,获得A226-△bldD/bldD菌株和A226/bldD菌株,利用TLC法和HPLC法对其发酵产物进行分析,并观察孢子生长状况。结果红色糖多孢菌A226中bldD基因失活后产红霉素水平明显降低,不能形成孢子;bldD基因的回复表达使A226-△bldD突变菌株产红霉素能力得到恢复,且孢子形成恢复正常;在红色糖多孢菌A226中过量表达bldD基因可提高红霉素产量,较出发菌株A226提高20%,同时可使孢子形成时间提前。结论在红色糖多孢菌中过量表达bldD基因,可获得红霉素高产菌株,同时会影响红色糖多孢菌形态分化进程。
- 何晶晶黄训端宋平郭金华陈惠鹏曹诚张部昌
- 关键词：红色糖多孢菌红霉素形态分化基因表达
- 红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因eryK的克隆及原核表达
- 2008年
- 目的:探讨红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因eryK在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法:将eryK基因克隆到表达质粒pET-22b(+),使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并对装液量、接种量、诱导时间、IPTG浓度和FeC l3浓度等表达条件进行优化。结果与结论:SDS-PAGE电泳显示,在相对分子质量44×103处有EryK蛋白条带,其含量占菌体总蛋白的58%以上。证明高GC含量的红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因EryK可以在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达,为体外研究EryK酶学相关性质以及大规模发酵奠定了基础。
- 赵皓黄训端张部昌孔小卫张书祥查向东
- 关键词：红色糖多孢菌
- 红霉素3"-O-甲基转移酶基因eryG克隆及表达被引量：1
- 2008年
- 目的:探索红色糖多孢菌红霉素eryG基因在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法:以红色糖多孢菌总DNA为模板,PCR扩增出eryG基因序列,克隆到原核表达载体pET-22b(+)上,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。从诱导剂IPTG的终浓度和诱导时间两个因素来优化eryG基因的表达条件。结果:eryG基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物EryG经SDS-PAGE分析相对分子质量约为33×103。表达条件经优化后,重组蛋白EryG表达量占菌体总蛋白的55%以上。结论:红色糖多孢菌红霉素eryG基因可以在大肠杆菌中高效地表达,为进一步研究EryG的相关酶学性质、分析其对红霉素发酵产物的影响奠定了基础。
- 袁华张部昌赵皓孔小卫黄训端查向东张书祥
- 关键词：红色糖多孢菌红霉素
- 辐照对糖多孢红霉菌M的诱变效应被引量：2
- 2009年
- 采用不同剂量的60Co γ射线辐照糖多孢红霉菌M孢子,并采用不同的菌种保护剂,以研究60Co γ射线对糖多孢红霉菌M的诱变效应。结果表明,使用20%甘油吐温保护效果较好,可作为诱变保护剂;当辐照剂量为400Gy时,致死率为90%左右可作为适宜诱变剂量。诱变处理后利用链霉素抗性突变选育得到1203株链霉素抗性突变株。其中5株形态发生较明显的变化,形态变异率为4.16‰;2株突变株的发酵液具有抑菌活性,正突变率为1.67‰。
- 庄韬刘超武杉杉黄训端张部昌曹磊张福生汪晓鸣
- 关键词：诱变效应
- 一种新的链霉菌表达载体启动子(英文)
- 2007年
- eryA基因直接控制着红霉素母环6-脱氧-红霉内酯B的合成,在红霉素生物合成过程中具有重要作用。本文克隆了eryA基因的启动子PeryA,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,构建了大肠埃希菌-糖多孢红霉菌穿梭型质粒。PEG介导原生质体转化法将穿梭型质粒分别转入糖多孢红霉菌A226与变铅青链霉菌JT46,荧光显微镜检测发现,此启动子在两菌株中都具有功能。随后,以变铅青链霉菌JT46为宿主,对PeryA启动子区域进行了深入研究,结果发现该启动子的-35区并不是必需的,仅有-10区、长度为41bp的该启动子在链霉菌中仍具有功能。定点突变证明-10区对于该启动子是必不可少的。因此,41bp的该启动子片段可作为链霉菌的有效启动子,这是迄今为止所发现的最短的启动子之一,可用于构建新的链霉菌表达载体。
- 吴杭张部昌查向东孔小卫马清钧
- 关键词：启动子糖多孢红霉菌变铅青链霉菌增强型绿色荧光蛋白
- ^(60)Co γ射线对糖多孢红霉菌的重复诱变研究被引量：2
- 2010年
- 糖多孢红霉菌963是60Co γ射线对糖多孢红霉菌M诱变筛选获得的具有抑菌活性的突变株。本实验采用60Co γ射线对糖多孢红霉菌963进行诱变,研究了重复诱变效应。结果表明,各个辐照剂量下,突变株963的致死率均低于出发菌株M。重复诱变后,菌株的形态变异率达24.1‰,比以M菌株作为出发菌株的单次诱变提高了4.8倍。实验获得了1株产物抑菌活性增强的突变株,其抑菌活性比菌株963提高了40%,正突变率为2.01‰,比单次诱变提高了20.36%。采用重复诱变的方法,总体变异丰富,菌株的形态变异率和正突变率显著提高,有利于提高诱变育种工作的筛选效率。
- 武杉杉刘超张部昌曹磊汪晓鸣
- 关键词：Γ射线糖多孢红霉菌诱变效应
- 产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G^-突变体的构建被引量：4
- 2008年
- 糖多孢红霉菌eryG基因编码产物为红霉素3"-O-甲基转移酶(EryG),失活eryG基因能阻断红霉素A的生物合成,积累其中间产物红霉素C。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模版,用重叠PCR方法扩增出eryG基因两侧约1600bp DNA片段(ΔG),其中去除了EryG上S-腺苷甲硫氨酸结合区域对应的290bp DNA片段。将该片段克隆于质粒pWHM3,构建了同源重组质粒pWHMΔG。PEG介导原生质体转化法将pWHMΔG转入糖多孢红霉菌A226中,通过染色体同源重组突变染色体上eryG基因。利用薄层层析、PCR和质谱方法筛选出一株eryG基因突变的糖多孢红霉菌A226G-突变体,此突变体主要积累中间产物红霉素C而不再合成红霉素A。通过eryG基因的功能补偿,糖多孢红霉菌基因工程菌A226G-G+可以恢复红霉素A的合成能力。
- 袁华黄训端张部昌刘道琴赵皓孔小卫张书祥
- 关键词：糖多孢红霉菌红霉素同源重组
