国家自然科学基金(30500091)
- 作品数：4 被引量：8H指数：2
- 相关作者：丁丽华叶棋浓周岩程龙赵静更多>>
- 相关机构：军事医学科学院福建农林大学沈阳药科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- GST-His双标签原核表达载体的构建及应用被引量：4
- 2009年
- 目的:在原有带有GST标签的pGEX-KG载体上添加His标签,构建双标签原核表达载体,以提高纯化后的融合蛋白的纯度。方法:双酶切pGEX-KG载体,将同样带有双酶切位点编码His标签的DNA序列酶切后与其连接、转化大肠杆菌DH5α、鉴定阳性克隆并测序,并将编码雌激素受体β(ERβ)的片段构建到该载体上,分别利用GST标签和His标签对ERβ蛋白进行2次纯化。结果:构建了GST-His双标签原核表达载体,将ERβ编码片段克隆入该载体中,在原核生物中得到表达;分别用GST和His抗体进行Western blot分析,均可检测到GST-His-ERβ融合蛋白的表达;利用此双标签载体纯化得到了纯度较高的ERβ蛋白。结论:GST-His双标签原核表达载体的构建对提高目的蛋白纯度具有重要意义。
- 赵静丁丽华仇玮祎牛畅陈力权甘纯玑叶棋浓
- 关键词：原核表达载体蛋白纯化雌激素受体Β
- 类泛素家族SUMO-1和UBC9的克隆、融合表达及纯化被引量：2
- 2008年
- 目的:克隆类泛素化家族SUMO-1和UBC9基因,表达并纯化二者与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增SUMO-1和UBC9的编码序列,分别将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,得到重组质粒pGST-SUMO-1和pGST-UBC9,分别转化大肠杆菌DH5α,表达融合蛋白GST-SUMO-1和GST-UBC9;用谷胱甘肽-Sepharose4B亲和纯化融合蛋白;用Western印迹检测融合蛋白的表达及纯化。结果:分别构建了SUMO-1和UBC9的融合表达载体;Western印迹检测表明,GST-SUMO-1和GST-UBC9融合蛋白获得表达;纯化得到了融合蛋白。结论:克隆、表达并纯化了SUMO-1和UBC9与GST的融合蛋白。
- 韦玮丁丽华张浩杨智洪崔家骏周岩李勤操毛建平叶棋浓
- 关键词：SUMO-1UBC9克隆融合蛋白
- 雌激素受体β潜在磷酸化位点突变体的构建及其活性测定
- 2008年
- 目的:构建雌激素受体(ER)β潜在磷酸化位点突变体,并在人胚肾细胞293T中检测其对ERβ下游基因转录的影响。方法:通过ERα和ERβ序列同源性比对,寻找ERβ的潜在磷酸化位点;以pcDNA3-ERβ-FLAG为模板,通过重组PCR,将ERβ264位、469位Ser编码基因突变为Ala编码基因,将突变片段连接到同样双酶切的pcDNA3-FLAG载体中,Western blot检测其表达;将重组质粒转入293T细胞中,检测突变体对含雌激素应答元件(ERE)的报告基因转录活性的影响。结果:ERα和ERβ序列同源性比对发现ERβ的264位Ser和469位Ser可能是其潜在的磷酸化位点;构建了ERβ264位和469位2个点突变体载体pcDNA3-FLAG-ERβ(S264A)和pcDNA3-FLAG-ERβ(S469A),Western blot可检测到ERβ突变体融合蛋白在293T细胞中表达。萤光素酶活性检测表明,在没有雌激素刺激的情况下,2个突变体的活性较野生型没有变化;加入雌激素后,突变体的活性较野生型略有升高。结论:ERβ的264位和469位Ser位点的磷酸化可能不是ERβ调节下游基因转录所必需的,活性升高可能是由于ERβ构象变化造成的。
- 周岩丁丽华程龙游松叶棋浓
- 关键词：雌激素雌激素受体Β磷酸化点突变
- 琼脂糖凝胶的合适浓度对于回收酶切后质粒载体的重要性被引量：2
- 2008年
- 目的:探讨琼脂糖凝胶的不同浓度对回收不同大小的酶切后质粒载体纯度的影响。方法:将2种质粒载体酶切,并经不同浓度的琼脂糖凝胶电泳分析,通过比较酶切前和酶切后载体的相对位置,研究胶浓度对回收酶切后载体纯度的影响。结果:不同浓度的琼脂糖凝胶中,酶切前和酶切后载体的相对位置会发生变化,对能否成功回收到纯度高的酶切后DNA片段有重要影响;质粒大小不同,胶浓度的影响也不同。结论:合适的胶浓度对于回收酶切后质粒载体具有重要意义,应选择合适的胶浓度回收酶切后质粒载体。
- 程龙周岩丁丽华叶棋浓
- 关键词：电泳
