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RNA干扰与慢性疼痛的基因治疗: 2009年; RNA干扰（RNA interference，RNAi）是1998年Fire等首次发现并命名的，是由双链RNA（dsRNA）分子在细胞内特异性诱导与之同源mRNA降解或翻译抑制，导致基因沉默的现象，是一种典型的转录后基因沉默（post—transcriptional gene silencing，PrrGs）。RNAi最主要的功能特点是其可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。RNAi技术已经成为模式生物、基因功能、基因治疗等研究领域中最有力的工具，; 程智刚潘冰冰王云姣于鹏李靖贻白念岳郭曲练; 关键词：RNA干扰基因治疗慢性疼痛转录后基因沉默 RNAI技术 RNA降解

鞘内注射DREAM-shRNA对神经病理性痛大鼠的镇痛效应被引量：3: 2009年; 目的评价鞘内注射转录因子下游调控元件拮抗因子-短发夹RNA（DREAM-shRNA）对神经病理性痛大鼠的镇痛效应。方法健康雄性SD大鼠，体重280—320g，采用坐骨神经慢性缩窄性损伤（CCI）法建立大鼠神经病理性痛模型，于CCI后第3天鞘内置管。取鞘内置管成功的大鼠24只，随机分为4组，每组6只，假手术组（Sham组）：仅暴露坐骨神经，不结扎；神经病理性痛组（NP组）：于CCI后第8天鞘内注射生理盐水10出；RNA干扰组（RNAi组）：于CCI后第8天鞘内注射含DREAM．shRNA的慢病毒5μl、生理盐水5μl；空白载体组（BV组）：于CCI后第8天鞘内注射慢病毒空白载体5μl、生理盐水5μl，连续注射7d。于CCI前1d（基础状态）、CCI后第7～14天（T1～8）测定热痛阈和机械痛阈，于CCI后第15天测定脊髓背角绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平。结果与基础值比较，NP组和BV组热痛阈降低，Sham组T1-8时热痛阈降低，RNAi组T1-4.6时热痛阈降低，4组CCI后各时点机械痛阈降低（P〈0．05或0．01）；与T1时比较，NP组和BV组其余时点热痛阈和机械痛阈降低，RNAi组L1-5时热痛阈降低，R时热痛阈和机械痛阈升高（P〈0．05或0．01）；与Sham组比较，NP组和BV组热痛阈和机械痛阈降低，RNAi组T2时机械痛阈降低，T8时升高（P〈0．05），热痛阈差异无统计学意义（P〉0．05）；与NP组比较，RNAi组热痛阈和机械痛阈升高（P〈0．05）。仅RNAi组脊髓背角有GFP表达，其余3组脊髓背角未见GFP表达。结论鞘内连续注射DREAM-shRNA可在一定程度上缓解大鼠神经病理性痛。; 于鹏程智刚王云姣李靖怡郭曲练姚明肖旺频; 关键词：神经痛注射

DREAM短发卡质粒载体的构建及在C6细胞中沉默DREAM基因的效应被引量：1: 2011年; 目的构建表达下游调控元件的拮抗分子(DREAM)基因序列特异性的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,检测其对C6细胞DREAM基因的干扰作用,为研究DREAM基因功能提供有力工具。方法为了构建pRNAT-U6.1/Neo载体介导DREAM shRNA表达的质粒,针对DREAM的19碱基大小的片段,分别设计3对寡核苷酸和1条非特异性阴性对照序列,形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pRNAT-U6.1/Neo载体(命名为pRNAT-DREAM),两对DNA双链连接后形成中间由9个碱基序列间隔的反向互补序列,构建成能产生DREAM shRNA的质粒。用构建成功的4条质粒转染C6细胞,分别采用Realtime PCR和蛋白印迹检测其DREAM基因的mRNA和蛋白表达。结果酶切、连接后构建成的质粒,经酶切与测序证实构建成功,无任何碱基突变。在培养的神经胶质细胞中转染率为85%左右,pRNAT-DREAM-Ⅱ和pRNAT-DREAM-Ⅲ显著抑制DREAM基因的表达。结论成功构建了能表达DREAM shRNA的质粒载体pRNAT-DREAM-Ⅱ、pRNAT-DREAM-Ⅲ,此项研究结果为DREAM信号通路的深入研究奠定了基础。; 程智刚莫秋华李靖怡王云姣白念岳贺正华胡浩杨胜辉鄢建勤郭曲练; 关键词：RNA干扰质粒

鞘内注射DREAM—shRNA对神经病理性痛大鼠脊髓背角p-CREB表达的影响被引量：2: 2009年; 目的探讨鞘内注射转录因子下游调控元件拮抗因子．短发夹RNA（DREAM-shRNA）对神经病理性痛大鼠脊髓背角磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（p-CREB）表达的影响。方法成年健康雄性SD大鼠，体重280～320g，采用坐骨神经慢性压迫（CCI）法建立大鼠神经病理性痛模型。于CCI后第3天鞘内置管。取鞘内置管成功的大鼠24只，随机分为4组，每组6只，假手术组（S组）：仅暴露坐骨神经，不结扎；神经病理性痛组（NP组）：于CCI后第8天鞘内注射生理盐水10出；RNA干扰组（RNAi组）：于CCI后第8天鞘内注射DREAM—shRNA5μl和生理盐水5μl；空白载体组（BV组）：于CCI后第8天鞘内注射慢病毒空白载体5μl和生理盐水5μl，各组连续注射7d。于CCI前1d（T0，基础状态）、CCI后第7～14天（T1-8）时测定机械痛阈。于CCI后第15天时测定脊髓背角绿色荧光蛋白（GFP）和p-CREB的表达水平。结果与基础值比较，各组各时点机械痛阈降低（P〈0．05或0．01）；与T1时比较，NP组和BV组T5-8时机械痛阈降低，RNAi组B时机械痛阈升高（P〈0．05或0．01）；与S组比较，NP组和BV组机械痛阈降低，RNAi组R时机械痛阈降低，B时升高，NP组、RNAi组和BV组脊髓背角p-CREB达上调（P〈0．05）；与NP组比较，RNAi组T6-8时机械痛阈升高，脊髓背角p-CREB表达下调（P〈0．05）。RNAi组脊髓背角可见大量绿色荧光，即GFP表达阳性，其余3组脊髓背角未见绿色荧光，即GFP无表达。结论鞘内注射DREAM—shRNA缓解大鼠神经病理性痛的机制可能与抑制脊髓背角p-CREB的表达有关。; 于鹏肖旺频姚明程智刚王云姣李靖怡郭曲练

DREAM短发卡质粒载体的构建和沉默C6细胞DREAM基因: ＜正＞目的:构建表达下游调控元件的拮抗分子（DREAM）基因序列特异性的短发卡RNA（shRNA）质粒载体,检测其对C6细胞DREAM基因的干扰作用,为研究DREAM基因功能提供有力工具。方法:为了构建pRNAT-U6....; 程智刚王云姣白念岳于鹏李靖贻贺正华杨胜辉郭曲练; 文献传递

携带DREAM基因shRNA的慢病毒载体的构建及其对坐骨神经缩窄损伤大鼠的镇痛作用被引量：5: 2009年; 目的:构建含下游调控元件的拮抗分子(downstream regulatory element antagonistic modulator,DREAM)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,利用RNA干扰技术抑制DREAM基因表达,开展对神经病理性疼痛基因治疗的实验研究。方法:将靶向大鼠DREAM基因的shRNA重组到慢病毒穿梭质粒中,将重组质粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM和慢病毒包装系统共转染293T细胞包装成慢病毒,收集病毒上清并进行载体病毒滴度的测定。将纯种健康清洁级成年雄性SD大鼠36只随机分为6组:正常对照组(N)、假手术组(S),根据干预手段的不同将大鼠坐骨神经缩窄损伤(chronic constriction injury of sci-atic nerve,CCI)模型组分为4组:CCI(C0)组,CCI疼痛模型建立后不给任何干预措施,生理盐水对照(C1)组,空白载体对照(C2)组,LV-shRNADREAM慢病毒载体治疗(C3)组。该3组大鼠于CCI后第7天分别于蛛网膜下腔注射生理盐水、空白载体、LV-shRNADREAM慢病毒载体。观察各组大鼠术后3,7,10,14,21 d的疼痛行为学的改变。实验结束取腰段脊髓荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Realtime-PCR测定DREAM基因的mRNA含量、Western印迹测定DREAM蛋白含量。结果:测序分析证实载体构建成功,成功进行慢病毒包装,得到病毒液滴度为1.0×108IFU/mL慢病毒载体。鞘内注射LV-shRNADREAM慢病毒载体后,CCI大鼠热痛阈和机械痛阈的异常明显得到改善(P<0.01),腰段脊髓神经细胞DREAM基因mRNA和DREAM蛋白的表达均显著降低(P<0.01)。结论:成功构建了携带大鼠DREAM基因有效shRNA的慢病毒载体,慢病毒携带的短发夹干扰RNA能干扰脊髓中DREAM的表达,为神经病理性疼痛的治疗提供了实验基础。; 王云姣程智刚于鹏李靖贻白念岳贺正华杨胜辉郭曲练; 关键词：神经病理性疼痛慢病毒载体

慢病毒介导的DREAM沉默治疗在坐骨神经慢性压迫模型大鼠疼痛中的作用及其对GALR1的表达调控被引量：2: 2013年; 目的甘丙肽受体1(galanin receptor 1,GALR1)信号通路在痛觉调节中发挥重要作用,该研究利用坐骨神经慢性压迫(chronic constriction injury of the sciatic nerve,CCI)大鼠模型,探索慢病毒介导的DREAM沉默治疗在CCI模型大鼠疼痛中的作用及其对GALR1的表达调控。方法选择健康雄性SD大鼠24只,随机分为4组(n=6):即RNA干扰组、空白载体组、单纯CCI组和正常对照组。鞘内置管前后分别测定基础痛阈,RNA干扰组和空白载体组于CCI后经微导管给予pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒和空白载体,并测定腰段脊髓内下游调控元件拮抗分子(downstream regulatory element antagonist,DREAM)和GALR1的蛋白表达。结果大鼠痛阈的变化:手术同侧热痛阈和机械痛阈测定结果表明,CCI处理后,RNA干扰组、空白载体组及单纯CCI组在各个时间点热痛阈和机械痛阈较正常对照组均显著降低(P<0.01);RNA干扰组鞘内注射后较注射前痛阈显著升高,治疗后相同时间点RNA干扰组较空白载体组及单纯CCI组痛阈亦显著升高。Western blotting结果表明,与其他实验组对比,RNA干扰组的DREAM蛋白表达水平显著下调,而GALR1蛋白表达水平较空白载体组、单纯CCI组亦有显著下调。结论 DREAM可以调控GALR1的表达,提示甘丙肽受体1信号通路参与DREAM基因调节大鼠神经病理性疼痛。; 潘冰冰程智刚孔高茵王云姣肖丹丁惠娟赵媛郭曲练; 关键词：RNA干扰神经痛

携带dream基因shRNA的慢病毒载体的构建及其对CCI大鼠的镇痛作用: ＜正＞目的:构建含dream基因有效shRNA的慢病毒载体,利用RNA干扰技术抑制dream基因表达,开展对神经病理性疼痛基因治疗的实验研究。方法:将靶向大鼠dream基因的shRNA重组到慢病毒穿梭质粒中,将重组质粒p...; 王云姣程智刚于鹏李靖贻白念岳贺正华杨胜辉郭曲练; 文献传递

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湖南省自然科学基金(05JJ40136)

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