浙江省自然科学基金(X205004)
- 作品数：12 被引量：33H指数：5
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- 创伤弧菌vvhA基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定
- 2006年
- 目的克隆创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)溶细胞素基因(vvhA),构建原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性。方法采用PCR技术从Vv GTC333和WZ01株DNA中扩增全长vvhA基因,T-A克隆后测定其核苷酸序列。采用pET32a质粒构建vvhA基因原核表达载体,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rVvhA表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯rVvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用兔抗Vv全菌抗体的Western Blot和兔抗rVvhA血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和免疫原性。结果所克隆的vvhA基因核苷酸序列与GeneBank公布的同源性分别为96.09%和98.26%。在0.5 mmol/L IPTG诱导下,rVvhA产量可占细菌总蛋白的18%。提纯的rVvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。重组蛋白rVvhA能与兔抗Vv全菌抗体发生特异性结合,免疫家兔可获得高效价抗体。结论该研究成功地构建了创伤弧菌vvhA基因高效原核表达系统,所表达的rVvhA具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Vv免疫检测试剂盒及疫苗的抗原。
- 张家敏应斌宇楼永良严杰
- 关键词：克隆免疫性
- 创伤弧菌溶细胞素基因重组蛋白复性条件的优化及溶血活性鉴定被引量：6
- 2007年
- 目的:对由大肠杆菌表达系统表达的创伤弧菌溶细胞素蛋白包涵体的复性条件进行优化并对其溶血活性进行评价。方法:表达、提取并纯化重组蛋白,并对其包涵体利用PBS透析复性、16种不同复性液透析复性和柱上复性方法进行复性比较,复性蛋白用溶血试验验证其活性。结果:利用三种蛋白复性方法,重组蛋白均不同程度得到复性,其中复性液中盐酸胍、助溶剂及盐离子作用显著。柱上复性效果明显,其复性率高达98%。利用兔红细胞溶血试验检测表明,重组蛋白具有溶血活性,其活性为0.2μg/HU。结论:成功对重组蛋白包涵体复性条件进行优化,并对复性后蛋白质的溶血活性进行鉴定,为今后的免疫学活性和变性蛋白质复性研究奠定了基础。
- 李桂军谢旦立楼永良
- 关键词：创伤弧菌溶细胞素溶血活性
- 创伤弧菌溶细胞素在大肠杆菌中的表达及其对应激因子的调控被引量：1
- 2008年
- 目的:用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素,对其溶血活性进行评价。并观察其作用肝癌细胞SMMC7721后,调控肝癌细胞SMMC772应激因子基因表达情况。方法:构建pET28a(+)-vvhA表达载体,对包涵体进行三步洗涤后,用金属亲和层析(6×His Tag)纯化重组创伤弧菌溶细胞素(rVVC),并用溶血试验验证重组蛋白活性。复性重组蛋白作用肝癌细胞SMMC7721后,RT-PCR方法检验SMMC7721细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、热休克蛋白90(HSP90)基因分泌调节情况。结果:用基因工程的方法成功获得高表达、高纯度(纯度≥96%)rVVC。兔红细胞溶血试验检测表明,rVVC具有溶血活性,其活性为0.2μg/HU(溶血单位)。RT-PCR结果显示,rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90 mRNA表达能力,但具有时间、剂量依赖性。结论:表达、纯化并复性的rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90 mRNA表达。提示rVVC在组织细胞损伤过程中发挥了应激作用。
- 李桂军楼永良桂静肖美英
- 关键词：创伤弧菌溶细胞素大肠杆菌表达溶血活性应激因子
- 抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的:纯化rVVC免疫家兔,制备并纯化多克隆抗体。观察复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合作用肝癌细胞SMMC7721后,肝癌细胞SMMC7721形态学和活性变化,评估抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC772的保护作用。方法:纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳兔获得多克隆抗体,多克隆抗体经过硫酸铵盐析、Sephadex G25除盐和DEAE-Sephadex G100层析纯化并进行Westerm Blot鉴定和抗体效价分析。复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合物作用肝癌细胞SMMC7721后,显微镜观察并以MTT法确定抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC7721的保护作用。结果:兔抗重组rVVC多克隆抗体经盐析法、分子筛和阴离子交换层析法纯化后,得到较纯的IgG分子。免疫印迹结果显示,抗重组rVVC蛋白多克隆抗体与纯化抗原呈现特异性反应条带。显微镜观察和MTT结果表明,纯化多克隆抗体能够阻断重组rVVC活性蛋白对肝癌细胞SMMC772的损伤。结论:成功制备了具有保护和阻断作用的兔抗重组rVVC多克隆抗体,为以后rVVC促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。
- 姚蔚周建娟李桂军谢旦立楼永良
- 关键词：创伤弧菌溶细胞素多克隆抗体阻断作用
- 基于vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR快速检测创伤弧菌的研究被引量：7
- 2007年
- 目的建立基于溶细胞毒素基因vvhA检测创伤弧菌（Vibrio vulnificus）的TaqMan实时荧光定量PCR。方法采用Primer Express软件，设计位于vvhA基因序列保守区的PCR引物和TaqMan探针，建立检测创伤弧菌vvhA基因100bp扩增产物的TaqMan实时荧光定量PCR。采用基因克隆技术，构建作为阳性对照的pMD19-vvhA100重组质粒。以最低扩增循环数（Ct值）、荧光强度增加值（△Rn）为观察指标，对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR条件进行优化。以不同浓度的创伤弧菌及其它8种细菌DNA和pMD19-vvhA100为模板，对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR的特异性、敏感性和重复性进行验证。创伤弧菌经腹腔和皮下注射及灌胃感染ICR小鼠，验证vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR对感染小鼠血液、皮下感染组织和肠内容物的检测效果。结果所建立的vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR仅对创伤弧菌DNA或pMD19-vvhA100呈现阳性检测结果，其检测灵敏度可达0．01ng创伤弧菌DNA或10^3个拷贝的pMD19-vvhA100，不同浓度pMD19-vvhA100三次检测结果的SD≤0．79，对腹腔和皮下感染创伤弧菌的小鼠血液、皮下组织标本检测结果均为阳性。结论所建立的创伤弧菌vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR具有快速、稳定、敏感、特异等优点，适合用于临床实验室进行创伤弧菌引起的败血症和创口感染快速诊断。
- 吴增辉楼永良卢中秋卢亦愚严杰
- 关键词：创伤弧菌TAQMAN探针实时荧光定量PCR
- 创伤弧菌溶细胞素融合蛋白对人Caeo-2细胞IL-8基因表达和IL-8分泌的影响
- 2010年
- 目的研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白（rVvhA）对人肠上皮细胞（human intestinal epithelial cell，Caco-2）IL-8基因表达的影响。方法IPTG诱导、表达、纯化、复性及Western blot鉴定rVvhA表达和纯化情况；CCK-8法检测rVvhA对Caco-2的细胞毒性作用；RT—PCR检测rVvhA诱导Caco-2细胞IL-8基因的表达情况；ELISA检测Caco-2细胞培养上清IL-8的分泌情况。结果Ni^2＋-NTA亲和层析柱对rVvhA进行纯化后纯度可达95％以上；CCK-8结果显示rVvhA活性蛋白显著降低了Caco-2细胞的存活率，有效浓度为1．5HU／ml（P〈0．05）；RT—PCR结果显示，0．6HU／ml rVvhA 30 min即可诱导Caco-2细胞IL-8mRNA基因表达上调；ELISA结果显示，Caco-2细胞经rVvhA作用后，培养液上清中IL-8多肽的表达时相在4h。RT—PCR与ELISA结果皆显示，IL-8基因的转录及IL-8表达皆具有时间-剂量依赖性。结论rVvhA在转录水平上能诱导人Caco-2细胞IL-8 mRNA表达，促进IL-8的合成，在创伤弧菌引起的过度炎症反应和败血症的发生、发展中可能具有重要意义。
- 谢旦立王波丁卉郑丽楼永良严杰
- 关键词：创伤弧菌IL-8
- 创伤弧菌溶细胞素融合蛋白重组、表达与细胞毒活性鉴定被引量：7
- 2008年
- 研究重组创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbili-cal vein endothelial cells,human ECV304)凋亡的作用。诱导含pET-28a(+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌表达创伤弧菌溶细胞素融合蛋白,应用Ni2+亲和层析方法对rVvhA进行纯化;利用分步稀释加透析相结合的方法进行蛋白质复性;绵羊红细胞裂解试验对复性后的rVvhA进行溶血活性初步测定;MTT法检测rVvhA对人ECV304细胞的体外毒性作用;应用Hochest33342/PI活细胞荧光双染及流式细胞术分析rVvhA对人ECV304细胞诱导凋亡的影响。结果显示,用Ni2+-NTAHisBand亲和层析柱纯化rVvhA纯度达88.6%左右;复性后的rVvhA有一定的溶血活性,其溶血活性具有时间-剂量依赖性;MTT结果显示rVvhA具有降低人ECV304细胞的存活率活性;浓度为2.0HU/mlrVvhA作用人ECV30412h后,其诱导凋亡的活性高于对照组和浓度为0.5HU/mlrVvhA处理组,具有剂量依赖性;浓度为2.0HU/mlrVvhA处理组加用40μmol/Lcaspase全酶抑制剂(Z-VAD-FMK)后凋亡率较2.0HU/mlrVvhA处理组有一定程度降低。rVvhA对人ECV304细胞具有诱导凋亡的生物学活性,推测诱导调亡途径可能与caspase家族有关。
- 桂静肖美英楼永良胡蝶严杰朱晔晶
- 关键词：创伤弧菌细胞凋亡CASPASE
- 创伤弧菌溶细胞素抗原表位预测及其噬菌体展示肽的构建
- 2008年
- 目的预测创伤弧菌溶细胞素(vibrio vulnificus cytolysin)的抗原表位,为研制多抗原肽疫苗(MAP)奠定基础。方法采用生物信息学技术对Vvc的T细胞和B细胞表位进行预测及分析。选取Vvc主要T细胞和B细胞联合表位肽构建噬菌体展示系统。PEG/NaCl沉淀法提纯重组噬菌体,SDS-PAGE鉴定目的重组PIII蛋白(rPIII)。Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白rVvc常规皮下免疫法制备兔抗血清。rVvc抗血清为一抗,采用Western blot对上述表位肽进行鉴定和筛选。结果预测的4个主要表位肽Vvha1、Vvah2、Vvha3和Vvha4在M13噬菌体中获得成功表达。采用rVvc抗血清为一抗,Western blot对上述表位肽进行鉴定和筛选:Vvha2、Vvha4反应强度高于Vvha1和Vvha3。结论本实验成功地构建Vvc主要T细胞和B细胞联合表位肽噬菌体展示系统。
- 肖美英楼永良严杰
- 关键词：创伤弧菌噬菌体展示B细胞表位T细胞表位
- 创伤弧菌溶细胞素基因在大肠杆菌中的表达及溶血活性鉴定被引量：11
- 2007年
- 目的用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素,并对其溶血活性进行评价。为今后的免疫学活性研究和单克隆检测试剂盒的研发奠定基础。方法构建pET28a(+)-vvhA表达载体,对包涵体进行三步洗涤后,用金属亲合层析(HisTag)纯化重组蛋白,并用溶血试验验证重组蛋白活性。结果用基因工程的方法成功获得高表达、高纯度(纯度≥96%)重组蛋白VVC。利用兔红细胞溶血试验检测表明,重组蛋白具有溶血活性,其活性为0.2μg/HU。结论成功用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素并对其纯化、复性条件进行优化。
- 李桂军楼永良严杰
- 关键词：创伤弧菌溶细胞素溶血活性
- 创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的制备创伤弧菌（Vibrio vulnificus）溶细胞素vvhA基因产物鼠源性单克隆抗体并鉴定其特异性和免疫性，为进一步研制创伤弧菌检测试剂盒奠定基础。方法采用IPTG诱导目的重组蛋白rvvhA表达，Ni—NTA亲和层析法提纯rvvhA，SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用杂交瘤技术和rvvhA-ELISA制备并筛选分泌rvvhA单克隆抗体的细胞株，有限稀释法进行细胞克隆。采用免疫双扩散法鉴定单克隆抗体类型。采用ELISA、免疫双扩散法和Western Blot鉴定单克隆抗体的效价和特异性。结果在0．5mmol／LIPTG诱导下，rvvhA产量可占细菌总蛋白的18％。提纯的rvvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。共获得9株rvvhA抗体阳性的杂交瘤细胞株，其中A5E8和C386株可持续分泌高效价特异性单克隆抗体，其抗体类型分别为IgG1和IgG2a。A5E8和C386单克隆抗体有较高特异性，与多种其它细菌蛋白不发生免疫反应，对rvvhA及创伤弧菌GTC333株和WZ01株蛋白的ELISA检测阳性的效价可达1：4000～1：8000、免疫双扩散效价为1：4～1：8，Western Blot结果显示此等单克隆抗体均能有效识别rvvhA。结论本研究成功地获得了2株稳定分泌rvvhA特异性单克隆抗体的鼠源性杂交瘤细胞株，rvvhA单克隆抗体可用于检测自然表达的创伤弧菌溶细胞素。
- 张家敏楼永良应斌宇严杰
- 关键词：创伤弧菌原核表达单克隆抗体
