国家教育部博士点基金(20120075110007)
- 作品数：10 被引量：9H指数：3
- 相关作者：孟清陈格飞李佳林瑛贾小娜更多>>
- 相关机构：东华大学吉林大学白求恩第一医院达尔豪斯大学更多>>
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- 相关领域：生物学更多>>
- 重组蜘蛛丝蛋白MiSp NT结构域在不同pH环境下的Trp荧光光谱及圆二色谱分析被引量：3
- 2014年
- 为明确蛛丝蛋白NT结构域的生物学功能,首次研究了MiSp NT结构域在不同pH条件下的二聚化动力学及二级结构特性.基于蛛丝蛋白MiSp全长编码基因,克隆并分别在BL21(DE3)和Rosetta-gami 2(DE3)中重组表达MiSp NT结构域:BL21(DE3)表达水平较高,约35 mg/L LB培养基,表达产物需经短暂超声和2 mol/L尿素促溶;Rosetta-gami 2(DE3)表达产物可溶性较好,但表达水平仅为BL21(DE3)一半左右.融合蛋白经凝血酶介导的2次Ni-NTA纯化,纯度达到95%以上.Trp荧光光谱分析表明,MiSpNT在pH为7.0左右时开始二聚化,pH5.7时二聚体为主要构象,pH T约为6.6.MiSpNT在pH 7.5,6.5和5.5条件下的CD图谱相似,均主要为α-helix,表明NT二聚化与二级结构水平的变化没有直接联系.本研究为进一步探索蛛丝蛋白NT结构域的结构和功能以及成丝机理提供线索.
- 陈格飞贾小娜郑翔宇孟清
- 关键词：二聚化
- 次壶腹腺丝蛋白功能模块的研究被引量：3
- 2014年
- 蜘蛛丝是天然的生物材料,具有潜在的巨大应用价值。研究蜘蛛丝蛋白质的结构与功能,有助于破解蜘蛛丝蛋白质的成丝机理,为制备优良材料学性能的仿生蜘蛛丝纤维提供理论依据。以MiSp蜘蛛丝的重复区和C端非重复区蛋白多肽为研究对象,在不同pH值和离子条件下,在体外研究其二级结构与成丝的关系。CD图谱显示:表达纯化的重组蜘蛛丝蛋白R1R2在pH 7.5、6.5和5.5时二级结构相似,均为无规则卷曲,而R1R2CT则主要呈现为α螺旋构象;扫描电镜结果表明:在以上3种pH条件下,只有pH 5.5时R1R2和R1R2CT才形成重组丝纤维,R1R2CT纤维形态较平整,类似于天然蛛丝纤维形态,而R1R2丝纤维则呈条带状,表面粗糙。另外,氯化钠不利于形成形态平整的丝纤维。该成果为研究蛛丝蛋白的成丝机理奠定基础,也为制备仿生蛛丝蛋白纤维提供理论依据。
- 贾小娜陈格飞孟清
- 关键词：Α螺旋纤维
- 应用突变的断裂蛋白质内含子标记蛋白质N端被引量：1
- 2014年
- 蛋白质的特异位点修饰可以帮助了解蛋白质的结构与功能.但是,现有的蛋白质特异位点标记方法种类有限,而且存在局限性,所以有必要开发新的蛋白质特异位点标记方法.以谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为研究对象,借助蛋白质反式剪接技术,建立了利用新型断裂蛋白质内含子对蛋白质进行N端标记的新方法.在这个方法中,通过简单的重组表达、标记和纯化得到带有荧光基团的小肽,经过蛋白质反式剪接,荧光基团被标记到蛋白质的N端.初步研究结果显示,标记效率可达到12%.
- 戴旭东李佳刘相钦孟清
- 关键词：蛋白质剪接荧光基团
- 大腹园蛛主壶腹腺丝基因的筛选及序列分析被引量：1
- 2015年
- 为研究蛛丝蛋白编码基因和蛋白的组成结构模式、进化,并为蛛丝仿生提供更多的基因资源,运用3D/PCR(three-dimensional polymerase chain reaction)技术对大腹园蛛(A.ventricosus)Fosmid基因组文库进行主壶腹腺丝(MaSp1)编码基因的筛选,并对部分序列进行分析.通过筛选实验室前期构建的Fosmid文库获得含有MaSp1基因的阳性克隆Av11-19-5,通过shotgun测序得到MaSp1部分基因序列MaSp1RC.MaSp1RC长786bp,编码的262个氨基酸(AvMaSp1RC)可划分为保守的C端非重复区(CT)和重复区(Rep).Rep主要由poly-Ala,Glyx和GlyGlyx等模块组成,Ala和Gly含量占总氨基酸的78%;CT中参与形成离子键的氨基酸及helix 4上的疏水模块高度保守.研究结果为蛛丝蛋白二聚化及仿生学研究提供了更多的基因资源.
- 张雪陈格飞孟清
- 关键词：大腹园蛛
- Euprosthenops australis牵引丝蛋白的原核表达被引量：1
- 2013年
- 参照GenBank收录的牵引丝蛋白编码序列,经过密码子优化,人工合成3段cDNA序列:NT、CT和4Rep,由Ⅰ型限制性内切酶BsaⅠ和BspMⅠ介导无缝拼接,分别构建4RepCT、NT4RepCT、NT8RepCT和NT12RepCT重组模块.通过改造表达载体和优化培养温度,成功提高了4RepCT的表达量(30 mg/L).另外还首次成功表达NT4RepCT和NT8RepCT重组蛋白模块,表达量分别为21 mg/L和8.5 mg/L.4RepCT表达量的提高及NT4RepCT和NT8RepCT的成功表达证实了融合标签TRX有利于提高蛛丝蛋白的表达水平,为E.australis全长牵引丝蛋白的表达奠定了基础.
- 张秀丽陈格飞林瑛李佳孟清
- 关键词：基因克隆融合蛋白原核表达
- 大腹园蛛次壶腹腺丝的表达被引量：3
- 2013年
- 基于大腹园蛛次壶腹腺丝Minor Ampullate Spidroin全长编码基因最新报道,研究了该基因的表达。利用PCR扩增该基因重复区一段长1 348 bp的片段P1,融合his-tag标签,构建酵母表达载体,在毕赤酵母菌GS115进行表达。同时构建大肠杆菌表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,P1在两种表达系统中均可实现表达。研究结果显示:P1在GS115中的表达经优化后产量、产率有较大提高,且远高于BL21(DE3)中的表达,相应的纯化效率GS115也远高于对照BL21(DE3)的表达。研究表明酵母表达系统更适合重复度高、且富含Gly/Ala的天然蛛丝蛋白基因的表达,为表达全长天然MiSp编码序列提供前期实验基础,也为大规模蛛丝蛋白的重组表达建立了平台。
- 杨子江陈格飞孟清
- 关键词：毕赤酵母表达系统大肠杆菌表达系统
- 蛛丝蛋白MiSp重组模块R1R2CT表达及其纤维化动力学研究被引量：1
- 2015年
- 为探索蛛丝蛋白模块单元在成丝过程中的作用,研究了大腹园蛛MiSpR1R2CT功能模块在不同pH条件下的纤维化动力学特性。大腹园蛛MiSp蛋白的R1R2CT功能模块与硫氧还蛋白融合,并在BL21（DE3）中进行表达,表达量约为15mg/LLB培养基。R1R2CT蛋白在pH7.5和6.5时较为稳定,在22h之内不发生纤维化;当pH值降至5.5时,R1R2CT在前2h内快速纤维化,3～5h趋势较为平缓;5h之后R1R2CT蛋白再次出现ThT信号的快速增长,7h后保持缓慢增长至22h。R1R2CT的增长速率及幅度高于单独的CT（C-termi-nal）蛋白,而单独的R1R2在pH7.5、6.5和5.5时均保持稳定,表明重复区依赖CT模块的快速纤维化模式。已有研究表明,CT在重复区纤维化过程中起晶核作用,该成果也从反面证实CT的晶核理论。
- 王锋陈格飞孟清
- 关键词：晶核
- 盐离子对次壶腹腺丝蛋白重组模块的影响被引量：1
- 2014年
- 为研究不同生理环境对蛛丝蛋白组装及成丝的影响,首次以MiSp序列为对象,研究其NTR1SR2CT重组模块在不同种类(浓度)盐离子条件下的聚集和成纤维特性及其在成纤维过程中二级结构的变化。基于大腹园蛛MiSp全长序列构建NTR1SR2CT模块,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21中成功表达。借助8 mol/L尿素裂解包涵体进行变性纯化得到NTR1SR2CT重组蛋白。NTR1SR2CT重组蛋白二级结构主要为无规则卷曲(Random coil)或α螺旋(Helix),在自然成丝及冻干过程中部分random coil或helix转变为β折叠(β-sheet),甲醇能促进该转变过程。另外,钾离子和磷酸根离子有利于NTR1SR2CT重组蛋白聚集从而促进丝纤维的形成。研究结果为成丝机理研究奠定了基础,同时也为工业化生产高品质的蛛丝纤维提供了条件。
- 王佳陈格飞孟清
- 关键词：丝纤维
- Split Inteins介导的多肽链两端标记
- 2015年
- 多肽链多位点特异性标记有助于了解蛋白质的结构与功能,特别是在蛋白质的动态构象研究方面.但是,现有的多肽链多位点特异性标记方法各有局限性,并且种类有限,所以有必要开发新的多肽链多位点特异性标记方法以满足研究需求.本文以Diub(ubiquitin dimer)蛋白为研究对象,借助S1和S11型2种不同的断裂蛋白质内含子(split inteins)的蛋白质反式剪接,将含有不同荧光基团的两种小肽成功剪接至靶蛋白的两端,最终达到对靶蛋白的末端标记目的.
- 张晓玲戴旭东林瑛孟清
- 关键词：蛋白质反式剪接荧光基团
- 悦目金蛛丝蛋白TuSp1重复模块特征被引量：2
- 2013年
- 针对蜘蛛管状腺丝蛋白(TuSp)结构进行克隆和分析,基于悦目金蛛(Argiope amoena,A.amoena)管状腺总RNA,利用简并引物和巢式聚合酶链反应(PCR)技术克隆AaTuSp1编码基因序列1273bp,其包含3个重复单元,每个重复单元编码176个氨基酸,重复单元之间的序列同源性高达97%以上,且富含丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser),其次是甘氨酸(Gly),组成了一系列PolyT,PolyA,PolyS,SQ和GX模体结构,推测与其独特的力学性能相关.系统进化分析表明,不同于典型蛛丝蛋白MaSp,Flag等,AaTuSp1及近系包卵丝蛋白形成一个独立的进化分支.研究结果为基于TuSp1合成仿生蛛丝提供了新的结构基因蓝图.
- 王金雷陈格飞李佳林瑛孟清
- 关键词：悦目金蛛进化
