国家自然科学基金(30500234)
- 作品数：9 被引量：15H指数：3
- 相关作者：向廷秀王丕龙刘少宁王丽娟陶小红更多>>
- 相关机构：重庆医科大学附属第一医院重庆医科大学第三军医大学西南医院更多>>
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- VP3和TRAIL基因共表达沙门菌载体对胃癌细胞生长作用的影响被引量：1
- 2009年
- 目的:构建鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)VP3基因和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apopto-sis-inducing ligand,TRAIL)基因的真核表达载体,并观察其对胃癌细胞生长的影响情况。方法:采用分子克隆技术,将VP3基因插入真核表达载体pBud-TRAIL中,构建获得质粒pBud-TRAIL-VP3,采用电转化法将该重组质粒转入减毒沙门菌SL7207,再直接转染胃癌细胞株SGC-7901。48h后采用RT-PCR检测VP3基因表达状况并在荧光显微镜下观察细胞内有无绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达。MTT法检测重组菌株对SGC-7901细胞生长状况的影响。AO/EB荧光染色检测其对肿瘤细胞凋亡率的影响。透射电镜观察胃癌细胞形态改变。结果:获得VP3基因正确插入的真核表达载体;重组质粒经减毒沙门菌介导转染胃癌细胞后,RT-PCR检测到VP3基因存在;荧光显微镜下观察到在转染细胞内有GFP表达;转染48h后可见到TRAIL和VP3对胃癌细胞生长有明显抑制作用(P<0.05),荧光染色可见胃癌细胞有凋亡现象,pBud-TRAIL-VP3能够明显提高胃癌细胞的凋亡率(P<0.05),透射电镜观察到转染细胞发生凋亡形态变化。结论:减毒沙门菌可将外源基因VP3和TRAIL基因导入胃癌细胞并进行表达,TRAIL和VP3对胃癌细胞的生长起协同抑制作用并能促进胃癌细胞的凋亡。
- 曹红丹向廷秀吕琳刘少宁王丽娟王丕龙
- 关键词：减毒沙门菌
- 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导HeLa细胞凋亡的差异蛋白质组分析被引量：1
- 2008年
- 目的比较分析肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)诱导人宫颈癌细胞系HeLa细胞凋亡前后蛋白质组中的差异表达蛋白,以进一步了解TRAIL的作用机制。方法以TRAIL诱导人宫颈癌细胞系HeLa细胞凋亡为模型,用双向电泳技术分离HeLa全细胞蛋白质,MALDI-TOF质谱鉴定,MS-FIit数据库分析,RT-PCR半定量方法检测JNK2的表达。结果鉴定得到12个明显的差异蛋白点,其中8个蛋白点上调,4个蛋白点下调。JNK2的表达与TRAIL有良好的量效关系。结论JNKK、MAPKAPK-2、Dip13beta、SHPS-1、DDBb、JEM-1、Macoilin、Leucine-rich repeat-containing protein14、Ena/VASP-likeprotein、PTPase-MEG2、GRB10 adaptor protein、THUMP domain-containing pro-tein1为TRAIL诱导HeLa细胞凋亡的新的相关蛋白。
- 赖国旗邱宗荫向廷秀宋敏胡小龙何明忠谭冬梅
- 关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体HELA细胞蛋白质组分析RT-PCR
- hAG（K1～3）联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因真核表达质粒对裸鼠胃癌皮下移植瘤的作用被引量：3
- 2009年
- 目的探讨hAG（K1～3）联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因在体内对裸鼠胃癌皮下移植瘤的生长抑制作用。方法通过亚克隆法构建重组质粒pBud—hAG及pBud—hAG-TRAIL，将人胃癌细胞SGC-7901注射裸鼠皮下形成移植瘤，并将移植瘤小鼠随机分为实验组和对照组。实验组包括pBud—hAG组和pBud—hAG—TRAIL组，各5只；对照组包括空质粒（pBud）组和生理盐水组，各5只。然后分别将2种重组质粒分次多点注入实验组移植瘤体内，并与对照组比较，通过检测移植瘤的体积和肿瘤微血管密度（MVD）研究其对肿瘤生长抑制情况及对肿瘤血管密度的影响。结果pBud—hAG组和pBud—hAG-TRAIL组移植瘤的MVD分别是（4．6±1．2）个／高倍视野（HP）和（4．8±0．9）个/HP（P〉0．05），而pBud组和生理盐水组分别是（17．4±2．4）个／HP和（18．2±2．7）个／HP，实验组和对照组之间差异有统计学意义（P〈0．05）。pBud—hAG组和pBud-hAG-TRAIL组的sTRAIL和hAGmRNA及蛋白表达均为阳性，其移植瘤体积分别是（1．862±0．017）cm^3和（1．325±0．012）cm^3（P〈0．05），而pBud组和生理盐水组分别是（3．637±0．032）cm^3和（3．521±0．028）cm^3，实验组与对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论hAG（KI-3）通过抑制血管内皮细胞的生长而抑制肿瘤血管的生成，而TRAIL则通过诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长，因此hAG（K1—3）联合TRAIL具有更强的抗肿瘤作用。
- 孙伟姜政向廷秀陶小红黄爱龙王丕龙
- 关键词：血管抑制素类TNF相关凋亡诱导配体
- 可溶性人TRAIL诱导胃癌细胞BGC-823凋亡的研究被引量：7
- 2008年
- 目的通过构建pBud-EGFP-TRAIL质粒体外观察可溶性人TRAIL蛋白(sTRAIL)对胃癌细胞BGC-823的作用。方法以EFGP基因为报告基因,sTRAIL为目的基因,构建pBud-EGFP-TRAIL双表达质粒,鉴定酶切和测序重组体。经脂质体转染法转染体外培养的胃癌细胞BGC-823,用荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR及Western blot进一步检测sTRAIL mRNA及其蛋白的表达,MTT法检测转染后对胃癌细胞的生长抑制率,TUNEL法观察细胞的凋亡情况,流式细胞仪分析转染后胃癌细胞的凋亡率。结果测序结果证实pBud-EGFP-TRAIL载体构建成功,质粒经脂质体转染后,通过表达sTRAIL蛋白对胃癌细胞发挥作用。MTT法显示转染该质粒的细胞的生长抑制率明显高于对照组,TUNEL法显示细胞核固缩,核染色质聚集或断裂,形成凋亡小体。流式细胞仪结果表明转染该质粒的细胞的的凋亡率明显高于对照组。结论在体外初步证实TRAIL能诱导胃癌细胞BGC-823凋亡。
- 李彦姜政向廷秀曾波陶小红王丕龙
- 关键词：肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体BGC-823细胞
- sTRAIL真核表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制作用被引量：4
- 2009年
- 目的探讨可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(soluble tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,sTRAIL)真核表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制作用。方法建立胃癌细胞株BGC-823裸鼠移植瘤模型,成瘤后于瘤内多点注射重组真核表达质粒pBud-EGFP-TRAIL,并设pBud-EGFP组和生理盐水组为对照,观察并记录肿瘤的生长情况。Western blot和RT-PCR检测sTRAIL mRNA和蛋白表达情况,HE染色观察肿瘤组织病理改变,TUNEL法及电镜技术观测肿瘤组织细胞凋亡情况。结果注射pBud-EGFP-TRAIL组的sTRAIL mRNA和蛋白为阳性,其瘤体大小明显小于pBud-EGFP组和生理盐水组,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色示pBud-EGFP-TRAIL组肿瘤细胞大量死亡,电镜下可见到典型凋亡细胞,TUNEL法显示其凋亡细胞明显增多。结论sTRAIL真核表达质粒pBud-EGFP-TRAIL瘤内注射对人胃癌裸鼠移植瘤有抑制作用。
- 李彦姜政向廷秀曾波陶小红王丕龙
- 关键词：胃肿瘤裸鼠肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体
- CARD18在凋亡素基因转染的胃癌细胞的表达及其在临床样本中的检测和意义
- 2013年
- 目的探讨caspase募集结构域家族成员18(CARD18)在凋亡素诱导胃癌细胞凋亡的机制及在胃癌发生发展中的作用。方法运用二维凝胶电泳法分离凋亡素作用胃癌细胞后表达的差异蛋白质,通过基质辅助激光解吸附飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)和生物信息学方法确定其中部分差异蛋白质,RT-PCR和Western blot法检测CARD18的表达,采用免疫组化检测56例胃癌组织及癌旁组织中CARD18的表达,并分析其与胃癌临床病理参数的关系。结果凋亡素处理后的胃癌细胞CARD18表达下调最明显,CARD18蛋白在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05),且与胃癌的分化程度和淋巴结转移有关(P<0.05)。结论 CARD18可作为一个潜在的预后标志物和靶向标志物。
- 谭翠刘少宁向展华
- 关键词：凋亡素胃癌细胞凋亡胃癌
- 真核表达载体pEGFP-N1-VP3的构建及在SGC-7901细胞中的表达和定位被引量：2
- 2009年
- 构建真核表达载体pEGFP-N1-VP3并稳定转染人胃癌细胞SGC-7901,观察EGFP-VP3融合蛋白在肿瘤细胞中的分布和亚细胞定位,探讨凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的机制。用PCR技术扩增出(凋亡素)VP3基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-VP3经脂质体介导转染SGC-7901细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察凋亡素在肿瘤细胞中的分布、亚细胞定位。用AO/EB荧光染色法检测其在体外诱导肿瘤细胞凋亡的效应。经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入载体pEGFP-N1,稳定转染细胞中EGFP-VP3在肿瘤细胞中得以高表达,转染后逐渐从细胞质迁移至细胞核,最后定位于细胞核内。AO/EB荧光染色观察到大量细胞凋亡。成功构建真核表达载体pEGFP-N1-VP3,并成功培养出表达绿色荧光蛋白和凋亡素的SGC-7901稳定细胞株。EGFP-VP3融合蛋白在肿瘤细胞中具有核定位效应,并诱导肿瘤细胞凋亡。
- 刘少宁祖毅向廷秀王丕龙王丽娟曹红丹吕琳
- 关键词：凋亡素融合蛋白真核表达胃癌细胞
- 减毒沙门菌介导的TRAIL和VP3对胃癌细胞的生长抑制作用及其机制
- 2008年
- 目的:利用沙门菌作为真核质粒携带载体,在体内外观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和鸡贫血病毒VP3基因对胃癌细胞的生长抑制作用。方法:将重组质粒pBud-TRAIL、pBud-VP3、pBud-TRAIL-VP3电转化减毒沙门菌SL7207,经稳定性鉴定后直接转染胃癌细胞株SGC-7901,24h后利用荧光显微镜观察有无融合绿色荧光蛋白表达,MTT法检测表达载体对胃癌细胞的生长作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期变化,并用免疫组织化学方法检测该载体对胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9表达的影响。荷瘤小鼠口服携带重组质粒的减毒沙门菌,8周后通过RT-PCR检测肿瘤组织内真核载体的表达状况,并测量荷瘤瘤体大小。结果:重组质粒能够在减毒沙门菌中稳定存在,经减毒沙门菌介导转染胃癌细胞后能够较好的表达,转染48h后可见到TRAIL和VP3对胃癌细胞生长有抑制作用,流式细胞仪观察到pBud-TRAIL-VP3能使胃癌细胞的凋亡率明显增高,TRAIL和VP3能够协同促进胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9的表达。体内实验提示pBud-TRAIL-VP3沙门菌载体能够在肿瘤组织中表达并能抑制肿瘤生长(P<0.05)。结论:减毒沙门菌将外源基因VP3和TRAIL基因导入胃癌细胞后,体内外实验证实该载体对胃癌细胞的生长起明显抑制作用,TRAIL和VP3联合作用机制与促进Caspase-3、Caspase-9的表达有关。
- 曹红丹吕琳向廷秀刘少宁王丽娟王丕龙
- 关键词：减毒沙门菌TRAIL基因VP3基因
- 表达VP3重组减毒沙门氏菌的构建和融合蛋白纯化
- 2008年
- 寻求有效的肿瘤基因疗法,构建鸡贫血病毒VP3的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗,并获得较纯的表达VP3基因的融合蛋白,初步研究其免疫原性。采用PCR技术扩增VP3基因,并将其与原核载体pET32α(+)重组。将重组后质粒转染E.coliBL21,得到表达VP3的融合蛋白,并将此蛋白通过50%的Ni+-NTA亲和树脂纯化。同时将重组质粒转染减毒沙门氏菌SL7207。经双酶切和PCR鉴定,成功构建了表达VP3的减毒沙门氏菌苗。融合蛋白通过50%的Ni+-NTA亲和树脂纯化,得到纯度在90%以上的纯化蛋白。成功构建了表达VP3的减毒沙门氏菌苗,并且获得纯化的表达VP3的融合蛋白,为进一步研究VP3的免疫保护作用及对抗肿瘤疫苗的研制打下基础。
- 王丽娟刘少宁向廷秀王丕龙
- 关键词：凋亡素减毒沙门氏菌融合蛋白纯化
