江苏省自然科学基金(BK2010177)
- 作品数：5 被引量：11H指数：2
- 相关作者：李望陈仁富温儒民刘俊杰程伟松更多>>
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- DNA甲基化对Ki-67启动子转录活性的影响被引量：6
- 2011年
- 目的观察DNA甲基化对Ki-67启动子转录活性的影响。方法使用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，使用甲基化酶（M．SssI、M．HpalI、M．HhaI）诱导Ki-67启动子DNA片段发生不同程度的甲基化，将甲基化的启动子片段插入pGL3-Basic载体得到甲基化Ki-67启动子荧光素酶报告质粒，并以非甲基化Ki-67启动子荧光素酶报告质粒作为对照，分别转染正常细胞（HL-7702、HUVEC）和肿瘤细胞（A549、EJ、Kert-3、Hela和SGC-7901），使用双荧光素酶报告基因检测系统测定甲基化的Ki-67启动子在这些细胞中的转录活性。结果甲基化Ki-67启动子的转录活性均有不同程度的下降，其下降幅度依次为M．SssI处理组〉M．HhaI处理组〉M．HpalI处理组，其中M．SssI处理组启动子的转录活性几乎完全消失。结论Ki-67启动子的甲基化抑制了其转录活性，抑制程度与DNA甲基化程度和甲基化位置有关。
- 李望钱国伟徐为田卉李连涛刘俊杰陈菲菲李慧中章龙珍郑骏年
- 关键词：DNA甲基化KI-67基因启动子转录活性
- 细胞核增殖抗原启动子调控荷载双基因RNA干扰的条件增殖腺病毒的构建被引量：2
- 2012年
- 目的构建细胞核增殖抗原（Ki-67）启动子调控表达Ki．67基因和人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因小干扰RNA（siRNA）的条件增殖腺病毒。方法（1）合成hTERT—siRNA插入pSilenc—er3．1，构建pShTERTsiRNA质粒。（2）分别酶切Ki-67启动子质粒pZKi-67、Ki-67．siRNA质粒pZD55-Ki-67-siRNA，获得Ki-67启动子片段和Ki-67．siRNA片段并连接，构建质粒pZKi-67-ZD-Ki-67-siRNA。（3）以pShTERT—siRNA为模板，PCR获得hTERT—siRNA及H1启动子片段，克隆进pZKi-67-ZD—Ki-67-siRNA，构建质粒pZKi-67-ZD—Ki-67-siRNA．hTERT．siRNA。（4）将其与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染293细胞，9～12d后出现病毒空斑。提取重组腺病毒DNA，行聚合酶链反应（PCR）鉴定。结果病毒ZKi-67-ZD—Ki-67-siRNA—hTERT—siRNA构建成功，其包含Ki-67启动子、Ki-67-siRNA、hTERT—siRNA片段。结论成功构建Ki-67启动子调控荷载Ki-67、hTERT双基因RNA干扰的条件增殖腺病毒，为研究靶向肿瘤治疗奠定基础。
- 陈仁富程伟松程乾李连涛方琳刘俊杰温儒民李望郑骏年
- 关键词：人端粒酶逆转录酶基因RNA干扰
- 野生型p53转录抑制肿瘤HeLa细胞Ki-67基因表达
- 2011年
- 目的观察野牛型p53对脖瘤HeLa绍庭Ki-67基因转录的影响。方法将不冠浓度的野生型p53表达质粒pCMV—p53（0．01、0．02、0．05、0．10和0．20Ixg）与Ki-67核心启动子质粒pGL-BK235瞬时共转染HeLa细胞，荧光素酶活性分析检测Ki-67核心启动子活性，逆转录-聚合酶链反应（RT～PCR）检测Ki-67mRNA表达。结果单独转染pGL3—8K235组相对荧光素酶活性为59．32±3．57，不同浓度pCMV—p53（0．01、0．02、0．05、0．10、0．20μg）处理组荧光素酶活性分别为32．03±0．59、21．67±0．38、13．03±0．49、9．63±0．42和9．61±0．11。除0．1、0．2μg浓度两组间差异无统计学意义（P〉0．05）外，其余各组间差异均有统计学意义（P〈0．05）。随pCMV—p53转入量的增加，Ki-67mRNA的表达量显著下降（P〈0．05）。结论野生型p53过表达可以有效抑制Ki-67核心启动子的活性、下调Ki-67基因的转录。
- 李望王梅娟徐为钱国伟李连涛刘俊杰陈菲菲李慧中裴冬生郑骏年
- 关键词：肿瘤P53转录
- 转录因子Sp1对人Ki-67基因表达的调控作用被引量：3
- 2011年
- 目的 观察转录因子Sp1对人肿瘤细胞Ki-67基因表达的调控作用.方法 Sp1真核表达载体pN3-Sp1转染人宫颈癌Hela细胞、肾癌OS-RC-2细胞、肺癌A549细胞,蛋白免疫印迹法检测Hela细胞Sp1蛋白表达,细胞免疫组织化学检测3种肿瘤细胞Ki-67蛋白表达.pN3-Sp1与Ki-67基因核心启动子pGLBK235共转染上述3种肿瘤细胞,双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性.以空载体pN3作为对照.结果 转染pN3-Sp1的Hela细胞Sp1蛋白表达量,是空载体对照组的2.4倍.转染pN3-Sp1的3种肿瘤细胞Ki-67蛋白表达量与pN3转染组比较均显著增加.pN3-Sp1、pGLBK235共转染3种肿瘤细胞的启动子转录活性均较单转染pGLBK235显著升高,在Hela、OS-RC-2、A549细胞中的启动子活性分别为仅转染pGLBK235的1.68、 1.34、1.83倍.结论 转录因子Sp1具有激活Ki-67基因转录作用.
- 李望钱国伟徐为田卉李连涛刘俊杰陈菲菲李慧中章龙珍郑骏年
- 关键词：KI-67基因转录因子SP1
- Ki-67核心启动子内最关键Sp1顺式作用元件的确定
- 2011年
- 目的 确定Ki-67启动子内调控转录最关键的Sp1顺式作用元件,探讨肿瘤细胞Ki-67基因高表达机制.方法 对Ki-67启动子内（-170～-145 nt）位置的Sp1顺式作用元件A2含有的两个Sp1一致性序列（-170/-160 nt）、（-159/-145 nt）分别作定点突变,把每个Sp1一致性序列的第3个碱基胞嘧啶＂C＂突变为胸腺嘧啶＂T＂,得到突变体MutA（-170/-160 nt）和MutB（-159/-145 nt）.使用双荧光素报告基因系统检测这些突变体在宫颈癌Hela细胞、人肾癌OS-RC-2和A549细胞中的转录活性.结果 2个Sp1一致性序列定点突变的启动子重组体在3种肿瘤细胞的转录功能均有显著降低,其中MutA在Hela细胞、OS-RC-2细胞、A549细胞中的活性分别降至突变前启动子活性的79.8%、65.9%、77.5%.MutB分别降至突变前启动子活性的36.9%、26.9%、28.6%.结论 Ki-67启动子-159～-145 nt区域的Sp1顺式作用元件对转录激活最为关键,起到调控肿瘤细胞Ki-67基因表达的作用.
- 李望钱国伟徐为田卉李连涛刘俊杰陈菲菲李慧中章龙珍郑骏年
- 关键词：点突变转录因子SP1
