国家自然科学基金(30701061)
- 作品数：7 被引量：53H指数：5
- 相关作者：王伟孔建强朱平程克棣王丽娜更多>>
- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院北京协和医学院药物研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 紫穗槐-4,11-二烯合酶基因在酵母工程菌中具有协同作用被引量：2
- 2011年
- 为了构建高产的紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌,主要探究了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的不同表达载体在酵母工程菌中是否存在协同效应。首先构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的酵母表达载体pGADADS,分别将pGADADS和pYeDP60/G/ADS转入酿酒酵母W303-1B和WK1中,获得6种能产生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌:W303B[pGADADS]、W303B[pYGADS]、W303B[pYGADS+pGADADS]、WK1[pGADADS]、WK1[pYGADS]和WK1[pYGADS+pGADADS]。对上述6种酵母工程菌进行发酵培养,通过GC-MS对发酵产物进行检测。结果显示,这6种酵母工程菌均能产生紫穗槐-4,11-二烯,其产率随着紫穗槐-4,11-二烯合酶基因拷贝数的增加而上升,且产生的紫穗槐-4,11-二烯对酵母工程菌没有产生毒性。导入多种ADS重组质粒后酵母工程菌的紫穗槐-4,11-二烯产率显著高于多个单质粒工程菌产生的紫穗槐-4,11-二烯之和。上述结果表明,同一宿主细胞中多种含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的表达载体之间存在明显的协同效应,这为构建青蒿素前体高产工程菌提供了一种思路。
- 孔建强支晓慧王伟程克棣朱平
- 关键词：青蒿素
- 紫穗槐-4,11-二烯合酶及其代谢工程研究进展被引量：4
- 2009年
- 紫穗槐-4,11-二烯合酶催化FPP(farnesyl pyrophosphate,法尼基焦磷酸)生成青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯,是青蒿素生物合成途径中的关键酶。本文对紫穗槐-4,11-二烯合酶的分子生物学和代谢工程研究进行了综述。紫穗槐-4,11-二烯合酶编码基因及其相关核酸序列已经得到了克隆。紫穗槐-4,11-二烯合酶cDNA全长1641bp,编码546aa。紫穗槐-4,11-二烯合酶最适pH范围较宽,但需要二价金属离子作为辅酶才能发挥作用,其产物和底物的特异性不高。在紫穗槐-4,11-二烯合酶作用下,FPP首先进行的是1,6-合环,然后是1,10-合环,形成紫穗槐-4,11-二烯。由于紫穗槐-4,11-二烯合酶在青蒿素生物合成中具有重要的意义,自从其基因被克隆测序后,先后被导入E.coli、S.cereviseae、烟草、拟南芥和A.nidulans,获得了能产生紫穗槐-4,11-二烯的各种工程菌或细胞,研究通过不同方式提高工程菌中紫穗槐-4,11-二烯产量的方法。
- 孔建强黄勇沈君豪王伟程克棣朱平
- 关键词：青蒿素工程菌
- 酵母代谢工程菌生产青蒿素中间体的研究
- 青蒿素是重要的抗疟药物,紫穗槐-4,11-二烯是其中间体。本论文构建了两种能生产紫穗槐-4,11-二烯的酿酒酵母工程菌:整合体型和质粒型。以朱栾倍半萜为标准品,对这两种酿酒酵母的代谢产物进行GC-MS检测,发现都能产生紫...
- 孔建强王丽娜朱平程克棣王伟
- 关键词：青蒿素酿酒酵母
- 文献传递
- 青蒿素生物合成研究进展被引量：8
- 2008年
- 目的介绍青蒿素生物合成的研究进展。方法以近几年有代表性的文献资料为依据,结合本实验室的工作,进行归纳,总结和分析。结果与结论青蒿素是一种具有独特结构的新型抗疟药,药物需求很大。近年来青蒿素生物合成研究进展迅速。青蒿素前体青蒿酸生物合成途径已基本明确,参与青蒿酸生物合成的酶基因都已经被克隆并进行了功能鉴定。将青蒿素生物合成相关基因导入微生物,利用微生物生产青蒿素前体物质青蒿酸的代谢工程取得了突破性的进展。但也有实验表明,在青蒿中可能存在两条青蒿素生物合成途径。
- 孔建强王伟朱平程克棣
- 关键词：青蒿酸青蒿素生物合成代谢工程
- 基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用被引量：5
- 2011年
- 目的构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体。方法通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列;通过常规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整合载体。为了确证该载体的效能,将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因克隆到该载体上,构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的整合型酿酒酵母工程菌。提取该工程酵母的基因组,通过紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的特异引物进行扩增,确认紫穗槐-4,11-二烯合酶基因是否已整合到酵母基因组上。发酵酵母工程菌,对发酵产物进行GC-MS检测,确认是否产生紫穗槐-4,11-二烯。结果构建了1个酵母整合载体,具有如下特点:①能将外源基因表达盒序列整合到酿酒酵母rDNA序列上,增加目的基因的拷贝数;②选择标记能反复应用,方便获得多拷贝的整合形式;③整合片段不需要酶切线性化,节省了内切酶,而且简化了操作程序。酵母基因组PCR结果表明,紫穗槐-4,11-二烯合酶基因已经整合到了酵母基因组上。以朱栾倍半萜为标准品,对该酿酒酵母工程菌的代谢产物进行GC-MS检测,发现其能产生紫穗槐-4,11-二烯,产量达到(91.33±7.57)mg/L朱栾倍半萜当量。结论初步成功构建了一个基于rDNA序列的酵母整合载体。
- 支晓慧王丽娜朱平王伟孔建强
- 关键词：酵母菌酿酒DNA核糖体
- 血红蛋白促进酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯产量的研究
- 目的提高酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量。方法紫穗槐-4,11-二烯是抗疟药物青蒿素的中间体,由紫穗槐-4,11-二烯合酶催化FPP环化形成。通过连续重叠PCR的方法将透明颤菌血红蛋白基因突变成用酵母偏爱密码子表...
- 孔建强沈君豪黄勇王伟程克棣朱平
- 关键词：透明颤菌血红蛋白
- 文献传递
- 血红蛋白促进酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯产量的研究
- 目的提高酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量。方法紫穗槐-4,11-二烯是抗疟药物青蒿素的中间体,由紫穗槐-4,11-二烯合酶催化FPP环化形成。通过连续重叠PCR的方法将透明颤菌血红蛋白基因突变成用酵母偏爱密码子表...
- 孔建强沈君豪黄勇王伟程克棣朱平
- 关键词：透明颤菌血红蛋白
- 文献传递
- HMG-CoA还原酶和FPP合酶基因拷贝数对紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌产量的影响被引量：12
- 2007年
- 从青蒿中克隆了紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS),从酿酒酵母中克隆了HMG-CoA还原酶(HMGR)催化结构域和FPP合酶(FPPS)基因。构建含ADS基因的酿酒酵母表达载体pYeDP60/G/AS,将其转入酿酒酵母,获得能产生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌,以朱栾倍半萜为参照,产量为10μg.L-1。另外构建了含HMGR和FPPS基因的酵母表达载体pGBT9/A/HMG/G/FPP,将该载体和pYeDP60/G/AS共转入酿酒酵母,得到第二个能产生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌,产量为23.6 mg.L-1,结果表明增加HMG-CoA还原酶和FPP合酶基因的拷贝数能显著增加酵母工程菌的紫穗槐-4,11-二烯产量。
- 孔建强程克棣王丽娜郑晓东戴均贵朱平王伟
- 关键词：HMG-COA还原酶
- 酵母工程菌制备紫穗槐-4,11-二烯的研究被引量：5
- 2009年
- 构建了两种能产生紫穗槐-4,11-二烯的酿酒酵母工程菌,其中附加体型工程菌W303-1B[pYeDP60/G/ADS]含有表达载体pYeDP60/G/ADS。整合体型工程菌W303-1B[rDNA:ADS]是将ADS基因的表达盒序列通过同源重组的方式整合到酿酒酵母W303-1B基因组中。GC-MS检测发酵产物,结果表明这两种工程菌均能产生紫穗槐-4,11-二烯,但附加体型工程菌产生的紫穗槐-4,11-二烯的产量要高于整合体型工程菌的产量。Southern杂交检测表明,ADS基因以单拷贝的形式整合到W303-1B基因组中,低于附加体型工程酵母中的ADS基因拷贝数。这些结果表明,ADS基因的拷贝数与酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量呈正相关。
- 孔建强沈君豪黄勇王伟程克棣朱平
- 青蒿素的合成生物学研究进展被引量：25
- 2013年
- 青蒿素是应用广泛的一线抗疟药。现在市售的青蒿素主要是从植物中提取出来的,含量稀少和需求广泛导致青蒿素供应不稳定。建立一种环境友好、廉价的生产青蒿素的方法将是未来解决青蒿素来源问题的有效方法。通过合成生物学技术来制备青蒿素,利用细胞工厂将是未来青蒿素生产的主要方式。本综述简单介绍了青蒿素的生物合成途径,并对青蒿素生物合成相关基因,如紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因、细胞色素P450氧化还原酶基因、青蒿醛双键还原酶和醛脱氢酶基因进行了重点介绍。此外,本综述针对近年来青蒿素合成生物学发展的特点以及影响底盘细胞制备目的产物的因素进行了详细的论述。
- 孔建强王伟程克棣朱平
- 关键词：青蒿素元件
