黑龙江省“十五”科技攻关项目(GC01B510)
- 作品数：17 被引量：78H指数：6
- 相关作者：李一经师东方宋岩陈淑红乔薪瑗更多>>
- 相关机构：东北农业大学东南大学黑龙江生物科技职业学院更多>>
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- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪轮状病毒JL94株vp4全基因克隆及原核表达载体构建
- 2005年
- 根据GenBank已发表的猪轮状病毒vp4基因保守序列,设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株vp4全基因;将扩增产物与载体pMD-18T连接进行序列测定并将测序结果同国外分离株进行序列比较。用限制性内切酶BamHI和SalI将vp4基因从pMD-18T-vp4切下;同样用BamHI和SalI双酶切表达载体pGEX-6P-1;将这2个双酶切产物连接并转化,通过酶切鉴定和PCR鉴定证明完成了vp4原核表达载体的构建。测序结果表明:vp4全基因长2362bp,JL94株同国外分离株BEN307株、Gottfried株vp4全基因片段核苷酸同源性分别为93.44%和69.43%;氨基酸同源性分别为96.06%和71.88%。说明JL94株同BEN-307株属同一VP4血清型,而同Gottfried株属于不同血清型。重组原核表达载体pGEX-6P1-vp4的构建为表达VP4蛋白,研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础。
- 于晓龙宋岩李宝贤李一经
- 关键词：猪轮状病毒VP4基因克隆原核表达载体构建
- 谷胱甘肽转移酶标签蛋白单克隆抗体的制备被引量：3
- 2008年
- 以纯化的谷胱甘肽转移酶标签蛋白(GST)免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用纯化的GST筛选,最终获得一株抗GST的杂交瘤细胞系(命名为1D10),染色体平均记数为90对,间接ELISA检测1D10细胞培养上清的效价为1:4 000。腹水效价为1:5×107,该单抗可以特异识别GST蛋白和带有GST标签(GST-tagged)的融合蛋白。
- 李桂伟乔薪瑗李海滨李一经
- 关键词：GST单克隆抗体间接ELISA
- 猪传染性胃肠炎S基因A D抗原位点在昆虫杆状病毒系统中的表达被引量：2
- 2006年
- 张炳丽唐丽杰范京慧王玉玲边亚娟钟涛李一经
- 关键词：杆状病毒系统抗原位点S基因昆虫养猪业发展
- 猪流行性腹泻病毒M基因及其片段原核表达效果分析被引量：11
- 2007年
- 将猪流行性腹泻病毒的M基因及编码M蛋白膜外区M基因片段(M)'分别亚克隆到原核表达载体pJLA605和pGEX-6p-1中,构建了重组质粒pJLA605-M、pGEX-6p-M-GST、pGEX-6p-M和pGEX-6p-M',转化大肠杆菌后,探索了M蛋白在N端和C端不带有谷胱苷肽巯基转移酶(GST)、N端和C端均带有GST、只在N端带有GST以及只含有M蛋白的膜外区M'蛋白的表达情况。SDS-PAGE分析结果表明,N端和C端带有GST的pGEX-6p-M-GST和只含有膜外区M'基因的重组质粒pGEX-6p-M'获得了高效表达,经Bandscan5.0软件分析,其表达产物分别以融合蛋白GST-M和GST-M'形式存在,表达量分别为20%和45%。在对重组质粒pJLA605-M转化的大肠杆菌诱导表达过程中发现菌体生长的抑制现象,说明M蛋白对宿主菌有一定的毒性,进一步提取包涵体进行SDS-PAGE发现M蛋白以包涵体的形式得以表达。猪流行性腹泻病毒M蛋白的毒性作用可能与M蛋白具有的出芽功能有关,因而表现出对大肠杆菌的细胞壁的破坏作用。
- 高慎阳邹运明李一经
- 关键词：猪流行性腹泻病毒原核表达
- 猪流行性腹泻病毒重组M蛋白膜外区的原核表达及鉴定被引量：4
- 2007年
- 高慎阳查恩辉乔薪瑗李一经
- 关键词：猪流行性腹泻病毒原核表达病毒重组蛋白膜猪传染性胃肠炎外区
- 猪轮状病毒vp4基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达被引量：6
- 2005年
- 本研究扩增猪轮状病毒中国分离株 JL94株VP4蛋白主要抗原编码区基因(1 756 bp),将测序结果与国外分离株进行比较;将该基因片段同载体pMel BacA连接后,与杆状病毒DNA共转染入昆虫细胞Sf9,经蚀斑筛选纯化重组病毒并再感染Sf9细胞获得 vp4 基因的表达,对表达的 VP4 蛋白进行 Western blot分析和血清中和抗体试验。结果表明:JL94株VP4主要抗原编码区基因与国外分离株 CRW 8 株、Gottfried株该基因片段氨基酸同源性分别为96.43%和67%,说明 JL94株与 CRW 8 株属同一 VP4 血清型,而与 Gottfried株属不同血清型。JL94 株VP4主要抗原编码区氨基酸最大变异处位于 aa81 aa207。vp4 基因在昆虫细胞中表达量占细胞总蛋白的 20%,Western Blot证实表达蛋白有良好的生物学活性。所表达的蛋白免疫小鼠产生中和抗体,阻断 JL94 在 MA104 细胞上引起的细胞病变。
- 宋岩师东方樊琛刘胜旺魏华李一经
- 关键词：猪轮状病毒VP4基因克隆真核表达
- 猪传染性胃肠炎病毒聚合酶基因反义RNA对病毒的抑制作用被引量：4
- 2006年
- 通过PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)聚合酶部分片段,反向插入逆转录病毒表达载体pLXSN中,用脂质体法将重组质粒plxas-pol转染PA317细胞,经抗生素G418筛选出稳定的产毒细胞克隆,分别扩大培养后,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,细胞克隆产生的重组病毒效价达9.0×105CFU/mL。用高效价假病毒感染IBRS2细胞,再经抗生素G418筛选,提取细胞克隆总RNA,经RT-PCR证明plxas-pol整合入IBRS2细胞。以TGEV感染IBRS2细胞和具有抗性的IBRS2细胞所产生的细胞病变为指标,证明该反义RNA对病毒有明显抑制作用,抑制率约为80%。用2×103和4×102TCID50/mL剂量的TGEV感染时,引起细胞死亡的时间分别为21 h和27 h,与对照组相比,抗性细胞系可明显延迟因病毒感染引起细胞死亡的时间。
- 于晓龙张海峰李一经
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒反义RNA
- 抗猪传染性胃肠炎M蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定被引量：8
- 2007年
- 以纯化的猪传染性胃肠炎病毒重组M蛋白免疫BALB／c小鼠，按常规方法进行融合、筛选，最终获得3株抗TGEVM蛋白的杂交瘤细胞系183、3C2、4A5，染色体平均记数为89对、92对、90对，间接ELISA检测183、3C2、4A5细胞培养上清的效价分别为1／4000、1／1000、1／4000，腹水效价分别为2×10^4、2×10^5、2×10^5。通过间接ELISA做病原检测，这3株单抗不与猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和猪轮状病毒发生交叉反应，而与传染性胃肠炎病毒显示良好的特异性。用制备的单抗通过间接免疫荧光做病原检测，发现染色后TGEV感染的细胞培养物在胞浆和细胞膜上出现黄绿色荧光，未接种病毒的细胞培养物未见有黄绿色闪亮荧光，结果表明，所制备的抗重组TGEVM蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性，为TGEV准确快速的病原诊断和TGEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。
- 乔薪瑗李桂伟张冠群李海滨李一经
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体间接ELISA间接免疫荧光
- 猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫研究被引量：4
- 2005年
- 将昆明鼠随机分为A,B,C,D4组,各组分别采用含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP7,含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组真核表达质粒pcDNA-N,pcD-NA-VP7和pcDNA-N、真核表达载体pcDNA3.1(+),肌肉注射3次,每次间隔2周。首次注射前后定期采血,检测血清抗体和外周血淋巴细胞中CD4+,CD8+T细胞数量的变化。A,C组小鼠血清在首免后第14天即可检出针对RVVP7的阳性抗体(P/N≥2.0)。B组小鼠血清在首免后第39天检出针对TGEVN蛋白的阳性抗体(P/N≥2.0)。A,B,C组小鼠在首免后外周血CD4+、CD8+T细胞数量与D组小鼠相比,在不同时间有显著差异(P<0.05),并明显高于D组小鼠。说明猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫后能诱发机体免疫反应。
- 师东方李一经王君伟贾永清马波刘宝全
- 关键词：VP7基因传染性胃肠炎病毒N基因核酸免疫
- 猪传染性胃肠炎病毒重组M蛋白免疫血清在病原检测中的应用被引量：3
- 2006年
- 以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组M蛋白免疫新西兰兔,制备免疫血清,用间接ELISA测得免疫血清效价达1∶14 000。通过间接ELISA进行病原检测,表明制备的免疫血清与全病毒具有较好的特异性。用免疫血清进行病原间接免疫荧光检测,TGEV感染的细胞培养物中多数细胞在其胞浆和细胞膜上出现黄绿色闪亮荧光,且荧光强度强,而未接种病毒的细胞培养物未见有黄绿色闪亮荧光,表明用所制备的抗TGEV重组M蛋白的免疫血清进行病原间接免疫荧光检测具有较高的特异性,为TGEV准确快速诊断与鉴别奠定了基础。
- 乔薪瑗葛俊伟郁茵宋岩李一经
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒间接免疫荧光试验间接ELISA
