国家自然科学基金(30500433)
- 作品数：9 被引量：31H指数：4
- 相关作者：刘家云苏明权郝晓柯骆晓梅杨安钢更多>>
- 相关机构：第四军医大学西京医院第四军医大学河北省人民医院更多>>
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- 针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较被引量：2
- 2007年
- 目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。
- 温伟红刘家云王凯薛茜孟艳玲赵晶贾林涛薛采芳王成济杨安钢
- 关键词：乙型肝炎病毒RNA干扰SIRNA
- 靶向X区的siRNA抑制乙型肝炎病毒基因的表达和复制被引量：4
- 2006年
- 目的构建针对乙型肝炎病毒(HBV)X基因的siRNA表达载体,观察其对HBV基因表达和复制的影响。方法设计并合成针对HBVX区基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG22·2·15细胞,潮霉素抗性筛选获得稳定细胞克隆,对所得细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测靶基因mRNA的抑制效果,荧光定量PCR检测HBVDNA。结果成功构建了针对HBVX基因的siRNA表达载体pSUPER-X1和pSUPER-X2,两种siRNA均能明显抑制HepG22·2·15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,抑制率分别为97%和88%,RT-PCR结果显示HBV的mRNA表达降低,荧光定量PCR结果证实siRNA能降低HBVDNA拷贝数2个数量级。结论载体产生的针对HBVX基因的siRNA能高效、特异地抑制HBV基因的表达和复制。
- 刘家云郝晓柯李庆霞黄红艳马龙洋温伟红贾林涛杨安钢
- 关键词：肝炎病毒乙型小分子干扰转染聚合酶链反应
- RNA干扰survivin基因增强SKBr-3细胞对多柔吡星敏感性的体外研究被引量：2
- 2010年
- 目的探讨抑制survivin基因的表达对人乳腺癌SKBr-3细胞化疗敏感性的影响。方法构建针对survivin基因序列特异性shRNA的表达载体,脂质体转染SKBr-3,G418筛选阳性克隆。实验分为RNA干扰组(S1&P),脂质体对照组(H1&P)和空白对照组。光镜观察转染后细胞的形态变化;0.5μg/ml多柔吡星作用于转染后的细胞,电镜观察细胞形态学变化;TUNEL染色、AnnexinV荧光标记检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖的抑制率。结果成功构建具有新霉素抗性的靶向survivin的序列特异性shRNA表达载体,基因测序完全正确;转染后干扰组细胞均发生细胞凋亡的形态学改变;低剂量多柔吡星诱导后,TUNEL染色结果 ,S1&P组凋亡细胞比例(23.6±4.8)%明显高于H1&P组(4.1±1.1)%和空白对照组(3.2±1.4)%(P<0.05),表明转染了RNA干涉载体的SKBr-3细胞对低剂量多柔吡星的敏感性显著增加;Annexin-V染色结果 :空白对照组凋亡比例为(17.43±3.12)%,H1&P组为(20.51±4.67)%,S1&P组为(68.76±8.49)%,后者与前两者比较均有统计学差异(P<0.05)。干扰组细胞凋亡率、细胞增殖的抑制率均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论体外实验证实抑制survivin基因的表达可提高乳腺癌SKBr-3细胞对多柔吡星的敏感性。
- 李庆霞王娟赵文清刘家云黄红艳张明杨安钢
- 关键词：RNA干扰SURVIVINSKBR-3细胞药物敏感性
- Survivin靶向microRNA表达载体的构建和鉴定被引量：7
- 2007年
- 目的:设计并构建Survivin靶向的microRNA表达载体,观察其对Survivin基因的抑制作用。方法:以Survivin为靶基因,根据pPRIME载体要求,设计针对Survivin的microRNA序列,PCR扩增获得目的片段并克隆到载体中,序列正确的载体脂质体转染Hela细胞,RT-PCR和Western blotting检测其对Survivin的抑制作用。结果:用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定、DNA测序证实构建的microRNA表达载体序列正确,后者在mRNA和蛋白水平上均能明显抑制Hela细胞中Survivin的表达。结论:Survivin靶向microRNA表达载体构建成功,并能抑制靶基因的表达,为其在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。
- 骆晓梅刘家云苏明权郝晓柯
- 关键词：MICRORNASURVIVIN靶向治疗
- 肿瘤特异性survivin启动子在前列腺癌细胞中的活性鉴定被引量：7
- 2007年
- 目的:克隆survivin启动子片段,并检测其在人前列腺癌LNCaP细胞和人正常张氏肝细胞中的转录活性,为该启动子在前列腺癌的靶向性基因治疗中奠定基础。方法:用PCR扩增survivin基因启动子S1pro和S2pro克隆入pPRIME载体,构建重组质粒pPRIME-S1pro和pPRIME-S2pro,脂质体转染LNCaP细胞和张氏肝细胞,检测survivin启动子在细胞中的转录活性。结果:survivin基因启动子在前列腺癌细胞中具有较强活性,其中S2pro启动活性明显高于S1pro,达到CMV启动子活性的39%。结论:survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性,可望成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。
- 骆晓梅刘家云苏明权郝晓柯
- 关键词：前列腺癌SURVIVIN启动子基因治疗
- survivin启动子与PSMA启动子/增强子在前列腺癌细胞系中的转录活性比较被引量：1
- 2012年
- 目的:通过研究并比较前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因启动子、增强子和survivin基因启动子在不同前列腺癌细胞系(LNCaP和PC-3细胞)中的转录活性,为前列腺癌的靶向性基因治疗提供依据。方法:采用PCR扩增PSMA基因的启动子、增强子和survivin基因启动子,分别克隆入pGL3-Basic,脂质体转染前列腺癌细胞和张氏肝细胞,检测各启动子在细胞中的转录活性。结果:survivin基因启动子在前列腺癌细胞中均具有较强活性,均明显高于PSMA启动子/增强子,其中S2pro启动活性最强,达到CMV启动子活性的1/3,然而,survivin启动子及PSMA启动子/增强子在肝细胞系中几乎不表达。结论:survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性,可望成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。
- 骆晓梅刘家云苏明权郝晓柯
- 关键词：前列腺癌前列腺特异性膜抗原启动子增强子
- 靶向survivin的microRNA和siRNA抑制前列腺癌细胞survivin基因表达和凋亡作用的比较被引量：3
- 2009年
- 目的:构建靶向survivin的microRNA表达载体,观察其与siRNA表达载体对survivin基因表达的抑制作用.方法:以survivin为靶基因,根据pPRIME设计针对survivin的microRNA序列,获得目的片段克隆到相应载体中,序列正确的载体脂质体转染前列腺癌PC-3细胞,RT-PCR和Western Blot检测其对survivin基因表达的抑制作用,流式细胞术和电镜观察其对细胞凋亡的影响.结果:双酶切鉴定、DNA测序证实构建的microRNA表达载体序列正确,序列正确的microR-NA和siRNA表达载体在mRNA和蛋白水平上均能明显抑制PC-3细胞中survivin的表达,流式细胞术和电镜结果显示其可促进PC-3细胞的凋亡,且microRNA表达载体的作用效果较siRNA表达载体强.结论:Survivin靶向microRNA和siRNA均能抑制靶基因的表达,诱导前列腺癌细胞凋亡,与siRNA相比,microRNA作用效果更强.
- 骆晓梅刘家云苏明权郝晓柯
- 关键词：小分子干扰
- survivin启动子的克隆及其在前列腺癌细胞系中的活性鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的克隆survivin启动子片段,并检测其在人前列腺癌细胞中的转录活性,为该启动子在前列腺癌靶向基因治疗中的应用提供实验依据。方法PCR方法扩增survivin基因启动子S1pro和S2pro,克隆入pGL3-Basic,分别构建重组质粒pGL3-S1pro和pGL3-S2pro,脂质体转染前列腺癌细胞和Chang liver肝细胞,检测sur-vivin启动子在细胞中的转录活性。结果survivin基因启动子在前列腺癌细胞中均具有较强活性,其中S2pro活性明显高于S1pro,达到CMV启动子活性的三分之一。结论survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性,有可能成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。
- 骆晓梅张南征刘家云苏明权郝晓柯
- 关键词：前列腺癌基因SURVIVIN启动子基因治疗
- RNAi抑制Survivin基因表达对乳腺癌SKBr-3细胞放射敏感性影响的研究被引量：5
- 2008年
- 目的:研究利用RNA干扰抑制Survivin基因的表达对人乳腺癌SKBr-3细胞放射敏感性的影响。方法:构建针对Sur-vivin基因的RNA干扰真核表达载体pSU-PER-S1并转染SKBr-3细胞,分别用RT-PCR和蛋白质印迹法检测Survivin mR-NA和蛋白表达水平的变化;流式细胞仪检测细胞周期;平板克隆形成实验计算细胞存活率,用单击多靶数学模型进行曲线拟合做图,求曲线参数D0、Dq和N值,比较细胞放射敏感性变化。结果:RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果表明,pSUPER-S1转染后的SKBr-3细胞中Survivin mRNA和蛋白水平显著下降;流式细胞仪检测结果显示,转染后的SKBr-3细胞G1期阻滞明显〔(74.03±8.91)%〕,高于对照组〔(44.21±12.03)%〕,S期细胞数减少〔(17.11±4.96)%〕,低于对照组〔(43.12±8.64)%〕,P<0.05;经不同剂量γ射线照射后的细胞存活曲线拟合作图后发现,转染后的细胞D0、N和Dq值均下降(D0=1.29,N=4.9,Dq=2.6),与对照组相比(D0=1.56,N=14.85,Dq=5.21)差异有统计学意义(P<0.05),提示细胞放射增敏感性增加。结论:利用RNA干扰技术抑制Survivin基因在乳腺癌SKBr-3细胞中的表达可以增加其对放疗的敏感性。
- 李庆霞刘家云黄红艳王娟吕品田段昕波张勇杨安钢
- 关键词：小分子干扰微管相关蛋白质类
