南京军区南京总医院科研基金(2011038)
- 作品数：1 被引量：4H指数：1
- 相关作者：杨斌龚隽葛京平孙颖浩更多>>
- 相关机构：第二军医大学更多>>
- 发文基金：南京军区南京总医院科研基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- ALKBH2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定被引量：4
- 2014年
- 目的 ALKBH2基因高表达于尿路上皮肿瘤,RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术难以稳定均一性的下调靶基因。文中旨在构建人源ABH2基因shRNA干扰慢病毒表达载体并进行鉴定。方法选取ABH2基因,分析该基因的编码区序列,进行单链oligo的设计及合成,利用PCR对合成的oligo进行拼接反应,将合成好的序列装入pcDNA3.1(+)载体并转化至感受态细胞DH5α,测序鉴定重组克隆中基因序列后构建表达载体pcDNA3.1(+)/ABH2。根据不同的载体分为4组:siRNA-468组、siRNA-571组、siRNA-662组和对照组。根据靶基因序列设计并合成3对shRNA,构建入U6载体。将shRNA载体分别与表达载体共转染入HEK293细胞,通过QPCR检测筛选出最优干扰序列。将筛选到最有效的shRNA-571干扰序列构建入慢病毒载体pL/shRNA/F载体,用构建的慢病毒干扰载体和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度。将LV-shRNA-571与过表达载体pcDNA3.1(+)/ABH2共转染肾癌细胞株ACHN,通过QPCR鉴定干扰效果。结果克隆测序验证无误,慢病毒载体构建成功。转染实验48 h后,收集293细胞分泌的病毒上清测定病毒的滴度为1.1×108TU/mL。对照组ABH2 mRNA相对表达量为0.785±0.082,siRNA-571组为0.078±0.006,RNAi后ABH2基因的mRNA表达水平(0.078±0.006)与对照组(0.785±0.082)相比显著降低(P<0.01),慢病毒PL/shRNA/F-ALKBH2-571对目的基因ABH2的干扰效率为92.2%。结论成功构建ABH2基因RNAi慢病毒载体并得到鉴定。
- 龚隽葛京平杨斌孙颖浩
- 关键词：RNA干扰慢病毒
