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嗜热厌氧乙醇杆菌组氨酸融合双活性乙醇脱氢酶的克隆、表达和酶学性质被引量：1: 2006年; 乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶是嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus乙醇代谢途径中的关键酶。根据高同源性的NADP(H)依赖型Ⅱ型乙醇脱氢酶(S-ADH)的序列设计引物,从T.ethanolicusJW200基因组中PCR扩增出编码S-ADH的基因,插入带组氨酸标签的pET-20(b),测序获得基因大小为1 059 bp,并在大肠杆菌JM109(DE3)中表达。表达产物经Ni亲和柱提纯达电泳纯。带组氨酸标签的重组NADP(H)依赖型乙醇脱氢酶具乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶双活性,能将乙酰辅酶A转化成乙醇.带组氨酸标签的重组酶酶学性质为乙醛脱氢酶活性最适值为pH 8.4,最适温度70℃;乙醇脱氢酶活性正、逆反应分别最适pH 8.0,最适T 55℃;最适pH8.9,最适为T 60℃。以乙酰辅酶A(Aceyl-CoA)为底物,该酶的Km为3.32 mmol/L,Vmax为12.5μmol/(min.mg)。T.ethanolicusJW200中双活性S-ADH的首次发现,建立了该菌乙醇代谢途径中从乙酰辅酶A到的乙醇的另一条通路。; 蒋宇邵蔚蓝; 关键词：乙醛脱氢酶乙醇脱氢酶

海栖热袍菌鞘的提纯及其成分和敏感性: 2008年; 海栖热袍菌(Thermotoga maritima MS8)是一种极端嗜热厌氧菌,细胞始终被一种鞘结构所包围,并且鞘在细胞两端呈现气囊状.通过膜截留法、透析法和等密度梯度离心法对鞘进行提纯,其中密度梯度离心法提纯的效果较理想.通过TLC分析,鞘由糖、蛋白、脂类组成,偏向膜的性质.通过对鞘的敏感性研究,发现蛋白酶K可以帮助鞘形成孔洞,并且仍可保留细胞的完整性,这可能有助于进一步促进T.maritima MS8基因转化工作的发展.; 周庆邵蔚蓝; 关键词：海栖热袍菌薄层层析透射电镜

嗜热乙醇杆菌中醛/醇脱氢酶的双启动子分析被引量：1: 2007年; 克隆了嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)中乙醇代谢的关键酶之一醛/醇脱氢酶(alcohol/acetaldehydedehy drogenase,AdhE)基因的上游假定启动子序列,并进行了结构分析。结果表明,adhE的上游序列是启动子,能启动报告基因在大肠杆菌中持续表达。首次发现adhE的启动子序列中存在两个独立的启动子(P172和P37)和核糖体结合位点(SD172和SD37),分别都具有完整功能,但其活性均低于完整的启动子序列。由此推测嗜热乙醇杆菌中adhE的表达受这两个启动子协同调控。; 彭惠毛忠贵武国干邵蔚蓝; 关键词：启动子报告基因系统

海栖热袍菌电转化技术的研究: 2011年; [目的]对海栖热袍菌电转化技术进行研究。[方法]采用不同参数即不同的方型电脉冲参数、指数衰退型电脉冲参数和高电压电击参数对海栖热袍菌感受态细胞进行电转化,得到的转化子进行PCR验证。[结果]试验中发现以150 V的低压方形电脉冲,室温厌氧条件下电击25 ms、1次,有利于T.maritima MS8的转化,但这种以整合质粒进行的转化效率极低。[结论]为提高T.maritima MS8的基因转化效率奠定了基础。; 彭静静蒋钰瑶周庆王未未邵蔚蓝; 关键词：海栖热袍菌电转化

嗜热乙醇杆菌中醇脱氢酶E的功能与调控被引量：1: 2008年; 对嗜热乙醇杆菌中的醇脱氢酶E(alcohol dehydrogenase E,AdhE)进行了克隆、表达和鉴定,证明先前报道的醛脱氢酶其实是AdhE。对AdhE在乙醇代谢中的功能与调控进行了研究。通过分析测定AdhE的酶学性质、AdhE在嗜热乙醇杆菌的不同生长时期的表达情况以及AdhE高表达时嗜热乙醇杆菌产乙醇/乙酸的比率变化,证明了AdhE的主要生理功能是促使乙醇产生。分析了嗜热乙醇杆菌在山梨糖(强还原性碳源)、葡萄糖(氧化还原性居中的碳源)和葡糖醛酸(强氧化性碳源)诱导培养下的AdhE表达量,证明氧化还原力是AdhE的表达调控信号之一。; 彭惠毛忠贵武国干邵蔚蓝

Electrotransformation of Thermotoga maritima MS8: 2011年; [Objective] The aim was to study on the electrotransformation of Thermotoga maritima MS8.[Method] Square waves,exponential waves and high voltage shock were used for the electrotransformation of T.maritima MS8,and the obtained transformants were detected by PCR.[Result] A single square electric pulse could be applied to cell sample in 0.2 cm ET cuvettes by using a Bio-Rad Gene Pulser set at 150 V,25 ms at room temperature,but the transformation efficiency was very low.[Conclusion] This research may improve the transformation efficiency of T.maritima MS8.; 彭静静周庆蒋钰瑶邵蔚蓝; 关键词：ELECTROTRANSFORMATION

嗜热厌氧乙醇菌JW200中乙醛脱氢酶的纯化被引量：5: 2007年; 研究了嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中乙醇代谢途径的关键酶之一乙酰CoA依赖型的乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH,EC 1.2.1.10)的纯化.结果表明,经DEAE Sepha-rose Fast Flow阴离子交换层析、两次为30%与80%硫酸铵盐析和相应盐浓度的Butyl-HIC疏水层析、TOYOPE-ARL HW-55F分子筛层析等提纯步骤,可得到电泳纯的ALDH,其提纯倍数为910倍,得率为7%.由SDS-PAGE和梯度PAGE测得全酶由4个亚基组成,全酶相对分子质量为360 000,亚基相对分子质量为100 000.; 彭惠毛忠贵武国干邵蔚蓝; 关键词：乙醛脱氢酶纯化

降解结晶纤维素极耐热葡聚糖酶重组菌的构建: 2006年; 极耐热纤维素酶在纤维素生物转化中具有潜在的开发前景,但极耐热酶缺乏对天然纤维素的分解能力。采用基因工程方法,将极耐热内切葡聚糖酶Cel12B基因和同样极端嗜热菌来源的纤维素结合域(CBD)区域融合,构建重组质粒pET-20b-Cel12B-CBD,转化至大肠杆菌JM109(DE3)诱导表达后,融合基因表达产物对结晶纤维素具有一定的分解能力。; 李相前邵蔚蓝; 关键词：基因融合内切葡聚糖酶

嗜热厌氧产乙醇杆菌乙醇代谢途径的初步研究被引量：8: 2005年; 以乙醇产量和细胞密度的提高为目标,从碳源和氮源入手,对嗜热厌氧产乙醇杆菌Therm oanaerobact-er ethanolicusJW 200的培养基作了初步优化以提高乙醇代谢途径中的关键酶的得率,便于提纯.葡萄糖浓度的提高对乙醇的产生有明显的诱导作用,但当葡萄糖浓度高于2%,乙醇产量反而下降.酵母粉对乙醇产量没有促进作用,单纯提高酵母粉浓度对细胞密度无显著影响,而同时提高葡萄糖和酵母粉浓度至2.0%,OD600最高可达2.0.2%葡萄糖,0.5%酵母粉对单位细胞乙醇产量的诱导效果最佳.T.ethanolicusJW 200粗酶液中未检测到丙酮酸脱羧酶的活性,经亲和柱C ibacron B lue-3GA部分纯化,在NAD洗脱蛋白中检测到辅酶A依赖型乙醛脱氢酶的活性,表明辅酶A依赖型乙醛脱氢酶是该菌乙醇代谢途径中的关键酶,它和乙醇脱氢酶共同作用,将乙酰辅酶A转化成乙醇.; 蒋宇邵蔚蓝; 关键词：葡萄糖酵母粉乙醇

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国家自然科学基金(30170511)