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抗A型肉毒毒素人源三结构域抗体的重组设计与表达被引量：1: 2005年; 以获得的抗A型肉毒毒素人源单链抗体ScFvB17为模板 ,PCR扩增抗体ScFv基因的重链可变区 (VH)和轻链可变区 (Vκ) ,以重链恒定区 1(CH1) 5′端 12个氨基酸的序列作为连接肽 ,构建成三结构域抗体分子 :VH_连接肽_Vκ(VH Vκ)。重组VH Vκ抗体分子在大肠杆菌中得到高效表达 ,其表达量占菌体总蛋白质的 34%以上。表达的蛋白质在菌内形成包含体 ,采用镍柱金属鏊合层析法对该包含体进行纯化 ,得到了纯度高达 95 %的VH Vκ。ELISA等实验结果显示 ,重组设计并制备的三结构域抗体蛋白VH Vκ不但可以特异识别毒素抗原 ,具有与原母本单链抗体ScFv相同的抗原特异性 ,而且具有了更高的相对亲和力和稳定性。; 王慧荫俊史晶孟露露李佩真; 关键词：A型肉毒毒素中和活性

A型肉毒毒素保护性抗原在酵母细胞中的表达与抗原性分析: 2004年; 目的 :在酵母系统中实现A型肉毒毒素 (BoNTa)Hc基因的可溶性分泌表达。方法 :将Hc基因克隆入表达载体pPIC9K ,用SacⅠ将重组质粒线性化 ,电转化巴氏毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115细胞 ,筛选G4 18抗性阳性整合子 ,进行Mut+ 表型株甲醇快速利用诱导。结果 :经过体外高拷贝整合子的筛选和诱导表达条件的优化 ,毒素Hc在pH 6 .5培养基BMMY中实现稳定的分泌表达 ,最终筛选到蛋白表达量占上清蛋白 10 %的分泌高表达株。免疫印迹和酶联免疫检测结果显示 ,重组BoNTaHc可以识别特异抗肉毒马血清并具良好的特异结合活性 ,可以诱导小鼠产生特异性抗体。结论 :酵母系统来源的具有良好免疫原性的重组BoNTa保护性抗原可以作为有效的候选重组疫苗分子。; 王慧荫俊; 关键词：A型肉毒毒素保护性抗原分泌表达酵母

噬菌体抗体库研究进展被引量：2: 2006年; 治疗性抗体的发展经历了异源抗体、人源化抗体和人源性抗体几个阶段。目前,人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向,而噬菌体抗体库技术的出现为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台,并且逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一。噬菌体抗体库技术是20世纪90年代初期抗体工程领域的一项重大进展,它是噬菌体展示和抗体库2种技术的集成,目前广泛应用于生物医学领域。本文对该技术的原理、类型、特点及研究进展进行了综述。; 杜威世孙志伟俞炜源; 关键词：噬菌体展示抗体库

虫媒黄病毒基因组复制的分子机制研究进展: 2007年; 虫媒黄病毒包括多种重要的可导致人类疾病的病原体。对其基因组复制的分子机制的研究一直是此类病毒致病机制研究的重点。本文着重介绍病毒基因组末端与其复制相关的调控元件、病毒非结构蛋白及宿主蛋白在虫媒黄病毒基因组复制中的作用。; 李晓峰秦鄂德; 关键词：黄病毒基因组结构

抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析被引量：1: 2004年; 目的 :实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体 (ScFv)的表达与纯化 ,并进行结合活性分析。方法 :克隆单链抗体基因ScFv(VH Linker Vk) ,利用pET2 2b表达载体构建重组表达质粒 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行IPTG化学诱导 ,固相亲和层析纯化蛋白 ,ELISA测定其特异结合活性。结果 :pET2 2b可稳定表达人源单链抗体基因 ,表达产物占全菌蛋白的 2 5 % ,表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化 ,蛋白纯度大于 95 %。竞争性ELISA测定结果表明 ,重组抗毒素在体外具有良好的活性 ,可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论 :采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达 ,重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。; 王慧荫俊; 关键词：A型肉毒毒素人源单链抗体纯化大肠杆菌

抗A型肉毒毒素人源单链抗体融合蛋白的重组设计被引量：3: 2005年; 以获得的抗A型肉毒毒素单链抗体为模板,进行融合改构,将人IgG1的Fc片段连接到ScFv的C端,在大肠杆菌中实现抗体融合蛋白ScFv-Fc的表达,表达量30%以上,蛋白以包含体形式存在,经过体外变复性的抗体融合蛋白ScFv-Fc,进行Protein G Sepharose柱亲和层析纯化,纯度达90%～95%.体外活性检测结果表明,重组抗体融合蛋白ScFv-Fc可以特异结合A型肉毒类毒素抗原,其相对亲和力近似于母本单链抗体,其稳定性高于母本单链抗体.; 王慧史晶孟露露李佩真白瑜荫俊; 关键词：A型肉毒毒素稳定性

西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能研究: 2008年; 目的研究西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据。方法通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5′UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性。结果5′UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低。第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合。同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低。结论Chin-01株5′UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点。; 李晓峰姜涛陈水平韩剑峰邓永强秦成峰于曼秦鄂德; 关键词：西尼罗病毒病毒非结构蛋白质类

西尼罗病毒Chin-01株基因组非编码区的序列测定及分析被引量：3: 2008年; 目的对西尼罗病毒(WNV)Chin-01株基因组非编码区(UTR)序列进行测定,了解其与已报道毒株的序列差异及系统发育关系。方法采用5′和3′RACE法对Chin-01株病毒基因组的UTR进行RT-PCR扩增,测定扩增产物序列,采用DNAstar软件对该株及其他9株WNV的UTR进行序列同源性分析,同时构建了基于3′UTR的系统发育树,并用RNA structure软件预测其二级结构。结果Chin-01株基因组5′和3′UTR分别为96nt和630nt,序列同源性分析的结果表明,其5′UTR与其他9株的同源性均达到99%或100%,而3′区UTR与埃及Eg101株的同源性最高,达98·1%。5′UTR的起始核苷酸为AG,并含有一段与3′UTR互补的14nt序列。3′UTR的末端为CUOH,包含一段完全保守的5nt序列,以及三个保守的称为CS2、RCS2和CS1的基序。二级结构预测发现,Chin-01株5′UTR呈长茎环结构,3′UTR的3′端也可形成多个保守的茎环结构。结论Chin-01株与埃及Eg101株亲缘关系最为密切。; 李晓峰姜涛陈水平韩剑峰邓永强秦成峰于曼秦鄂德; 关键词：西尼罗病毒非翻译区

RIG-I样受体与RNA病毒识别被引量：14: 2008年; RIG-I样受体(RIG-I likereceptors,RLR)是一类新发现的模式识别受体,能够识别细胞质中的病毒RNA,通过RLR级联信号诱导干扰素和促炎症细胞因子的产生,对抗病毒天然免疫的建立起着非常重要的作用。RLR信号通路既受宿主的严格调控,也能够作为病毒逃避宿主干扰素反应的靶点。本文重点讨论了RLR及其在RNA病毒识别和抗病毒天然免疫中的作用。; 秦成峰秦鄂德; 关键词：天然免疫 RNA病毒干扰素 RIG-I

新型pⅨ噬菌体展示系统的建立及初步评价: 2005年; 目的:构建新型噬菌体展示载体,评价其展示效果,为构建scFv库寻找新的展示体系。方法:PCR分离、扩增M13KO7中pⅨ蛋白编码基因,克隆入噬菌体展示载体PHB-gⅢ,替换原载体中的gⅢ-CT段,构建载体PHB-pⅨ,并将相对分子质量约50×103的碱性磷酸酶的编码基因分别克隆入两展示载体,观察其展示碱性磷酸酶能力的差别。结果与结论:成功构建了展示载体PHB-pⅨ,该载体具有与PHB-gⅢ相当的展示碱性磷酸酶的能力,且相同滴度的PHB-gⅢ噬菌体DNA含量略高于PHB-pⅨ噬菌体DNA含量,提示PHB-gⅢ系统展示外源蛋白时存在感染能力下降。PHB-pⅨ系统具有用于展示噬菌体抗体库的良好应用前景。; 王双孙志伟杜威世张锦超俞炜源; 关键词：噬菌体展示抗体库

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国家重点基础研究发展计划(2002CB513205)

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