博士研究生创新基金(2012D05)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
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- 重组pcDNA 3.0-WWOX构建对胆囊癌细胞表达及△Ψm的影响被引量：1
- 2016年
- 目的体外构建及鉴定Pc DNA3.0-WWOX真核表达载体,探讨过表达WWOX对人胆囊癌细胞WWOXm RNA表达、蛋白表达及跨膜电位(△Ψm)的影响.方法提取人胆囊癌细胞总RNA,RT-PCR反应合成WWOX的c DNA,PCR产物回收纯化.目的基因WWOX和pc DNA3.0载体经限制性内切酶ECORⅠ和XhoⅠ酶切,将双酶切WWOX片段与pc DNA 3.0载体在T4 DNA连接酶的作用下进行连接重组.pc DNA 3.0-WWOX重组质粒转化后,提取质粒经双酶切鉴定及测序鉴定.将pc DNA 3.0-WWOX重组质粒转染人胆囊癌GBC-SD细胞,应用RT-PCR、Western Blot检测WWOX基因的表达水平、JC-1染色检测胆囊癌细胞线粒体跨膜电位(△Ψm)变化.结果成功构建了pc DNA3.0-WWOX重组载体,经测序DNA序列与Gene Bank中WWOX序列一致.成功转染pc DNA3.0-WWOX重组质粒至胆囊癌GBC-SD细胞中.RT-PCR及Western blot结果显示:胆囊癌GBC-SD细胞转染pc DNA3.0-WWOX重组质粒48 h后pc DNA-3.0-WWOX组灰度比值明显高于各对照组(P<0.05),对照组间m RNA表达量差异无统计学意义(P>0.05).pc DNA3.0-WWOX组蛋白表达灰度比值均明显高于各对照组(P<0.05),对照组间蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05).pc DNA3.0-WWOX组细胞线粒体内绿色荧光信号较对照组增高(P<0.05),而对照组间细胞线粒体内绿色荧光信号差异无统计学意义(P>0.05).结论体外成功构建了Pc DNA3.0-WWOX重组载体,顺利进行了重组载体的转化和转染实验.靶向Pc DNA3.0-WWOX重组载体可有效抑制胆囊癌细胞WWOXm RNA降解,促进其蛋白的表达,同时有效促进细胞的早期凋亡.WWOX可能参与线粒体依赖的凋亡途径调控胆囊癌细胞的生长.
- 魏东杨珮吴雪松戈佳云施智甜王琳邹浩张小文
- 关键词：胆囊癌细胞跨膜电位
- 靶向miRNA干扰Bmi-1诱导胆囊癌细胞凋亡及上调Caspase-3表达的实验研究
- 目的通过靶向抑制原癌基因Bmi-1表达,观察其诱导胆囊癌细胞凋亡及上调Caspase-3蛋白表达的效应,探讨其在胆囊癌形成中的分子机制。方法通过前期成功构建miRNA-Bmi-1重组质粒转染GBC-SD细胞株,然后将其分...
- 魏东张小文王琳邹浩吴雪松戈佳云
- 关键词：GBC-SD重组质粒细胞凋亡
- 文献传递
- 靶向miRNA干扰Bmi-1表达对人胆囊癌细胞增殖效应的影响被引量：2
- 2014年
- 目的:通过体外RNAi干扰技术靶向抑制原癌基因Bmi-1表达,观察其对胆囊癌细胞增殖的效应及对细胞周期的影响。方法:针对Bmi-1不同位点构建4个miRNABmi-1重组质粒,采用RT-PCR和Western blot检测各组Bmi-1 mRNA和蛋白表达,选择干扰效果最明显组质粒转染胆囊癌GBC-SD细胞,48 h后采用BrdU及流式细胞仪检测细胞增殖及细胞周期变化。结果 :RT-PCR显示miRNABmi-1重组质粒1、3、4组mRNA表达明显低于对照组(P<0.05);Western blot显示miRNABmi-1重组质粒2、3、4组蛋白表达明显低于对照组(P<0.05);选取第4组(mRNA及蛋白表达抑制效果最强)质粒转染GBC-SD细胞,BrdU显示mRNABmi-1-4组细胞增殖抑制明显,增殖率为46.63±5.31,明显低于对照组(P<0.05);细胞周期显示miRNABmi-1-4组G0/G1期细胞增加(72.20±1.71),G2/M和S期细胞减少(18.30±7.21,9.50±6.01),与对照组比较,差异具有显著性(P<0.05)。结论:靶向沉默Bmi-1表达,能有效抑制胆囊癌细胞增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期,Bmi-1可能成为胆囊癌基因治疗的有效靶点。
- 魏东邹浩王琳吴雪松骆志玲王滔张小文
- 关键词：胆囊肿瘤增殖细胞周期
