国家自然科学基金(30571950)
- 作品数：20 被引量：64H指数：6
- 相关作者：马丁卢运萍翁丹卉邢辉宋晓红更多>>
- 相关机构：华中科技大学石首市人民医院首都医科大学附属北京佑安医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 糖原合酶激酶-3β磷酸化抑制顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡的研究被引量：6
- 2009年
- 目的探讨增加糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)的磷酸化状态对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的作用。方法体外培养人卵巢癌细胞株OV2008细胞,运用GSK-3β特异性抑制剂LiCl增加磷酸化GSK-3β的表达,应用流式细胞仪检测不同浓度顺铂诱导的细胞凋亡,Western blot检测GSK-3β及磷酸化GSK-3β蛋白的表达。结果流式细胞仪检测结果显示,梯度增加的顺铂(40、80、120μmol/L)作用于OV2008细胞24 h,其凋亡率不断增加,分别为(4.55±1.64)%、(25.50±0.94)%和(53.80±1.62)%;而应用抑制剂预孵育的细胞,不同浓度顺铂作用24 h后凋亡率分别为(2.10±0.80)%(、15.75±0.97)%和(20.45±0.87)%;Western blot显示,抑制剂LiCl作用后,细胞的磷酸化GSK-3β表达明显增加,并且顺铂作用亦可引起磷酸化GSK-3β表达上调;流式结果还显示,PI3K的特异性抑制剂LY294002作用后使顺铂诱导的细胞凋亡率从(18.75±0.70)%增加至(28.40±1.50)%。结论磷酸化GSK-3β表达增加可抑制顺铂诱导的卵巢癌细胞的凋亡。
- 宋晓红翁丹卉邢辉卢运萍王世宣马丁
- 关键词：糖原合酶激酶-3Β顺铂细胞凋亡卵巢癌
- AKT2基因沉默抑制卵巢癌细胞侵袭和粘附能力的实验研究被引量：4
- 2008年
- 目的:探讨AKT2基因对人卵巢癌细胞A2780侵袭和黏附活性的影响。方法:构建AKT2基因的短发卡状RNA质粒转染人卵巢癌细胞A2780,运用RT-PCR、蛋白质免疫印迹法比较转染前后AKT2表达的差异;用transwell小室检测细胞侵袭人工基底膜的能力;MTT法检测卵巢癌细胞与细胞外基质黏附能力。结果:与对照相比,构建shR-NA表达载体可抑制AKT2 mRNA转录和蛋白的表达;AKT2表达下降后,穿透重组基底膜的细胞数明显下降(P<0.05),且可显著抑制细胞与细胞外基质的黏附(P<0.05)。结论:靶向AKT2 shRNA能有效地抑制卵巢癌细胞中AKT2基因的表达,并抑制卵巢癌细胞体外侵袭和黏附能力。AKT2基因有可能成为治疗卵巢癌的新途径。
- 孙冬岩夏曦翁丹卉卢运萍马丁
- 关键词：卵巢肿瘤基因AKT2RNA干扰
- PTEN基因转染对卵巢癌A2780细胞周期和增殖能力影响的研究被引量：5
- 2007年
- 目的:研究外源性PTEN基因稳定转染对人卵巢癌A2780细胞周期和增殖能力的影响。方法:构建PTEN基因的野生型真核表达质粒pEGFP-C1-WT-PTEN和突变型表达质粒pEG-FP-C1-C124A-PTEN,以脂质体介导法转染体外培养的人卵巢癌细胞株A2780,同时转染空载体pEGFP-C1质粒,以未转染细胞为对照(转染成功后分别命名为WT-PTEN/A2780组、C124A-PTEN/A2780组、pEGFP-C1/A2-780组和A2780组。应用RT-PCR、Western blot方法分析目的基因及其蛋白表达,并采用MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞周期。结果:与对照细胞相比,WT-PTEN/A2780组和C124A-PTEN/A2780组PTEN mRNA及PTEN蛋白出现明显的高表达,与对照组细胞相比差异有统计学意义(t=5.300,P=0.034;t=11.963,P=0.007;t=7.869,P=0.016;t=22.421,P=0.002);WT-PTEN/A2780组细胞生长速度明显慢于未转染A2780细胞,然而C124A-PTEN/A2780组和pEGFP-C1/A2780组细胞生长速度无明显变化。流式细胞术显示WT-PTEN/A2780细胞G1期细胞数增加到(71.18±4.34)%,S期细胞数变为(17.48±1.96)%,与对照组相比差异有统计学意义(t=19.508,P=0.003;t=25.354,P=0.002),提示从G1期到S期发生抑制。结论:野生型PTEN可依赖其磷酸酶活性使A2780细胞在G1/S期发生细胞周期阻滞,并抑制A2780细胞增殖。
- 吴卉娟吴海涛翁丹卉邢辉卢运萍马丁
- 关键词：卵巢肿瘤PTEN基因增殖细胞周期
- 人卵巢癌多细胞球体的P-gp蛋白表达与p27蛋白表达的相关性研究被引量：4
- 2006年
- 目的:检测人卵巢癌多细胞球体中p27和P-gp的表达。观察P27反义寡核苷酸(p27-ASON)抑制p27表达前后人卵巢癌多细胞球体多药耐药P-糖蛋白(P-gp)的表达,探讨P-gp蛋白表达与p27蛋白表达的相关性及p27反义寡核苷酸对卵巢癌细胞多药耐药的逆转作用。方法:以单层细胞为对照,以三维培养方法获得的人卵巢癌A2780、CAOV3多细胞球体(MCS)为模型,通过脂质体将p27-ASON转染入两卵巢癌细胞株,采用流式细胞仪(FACS)、蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测p27、P-gp蛋白水平的表达;激光共聚焦显微镜(Confocal)检测p27、P-gp蛋白的亚细胞分布。结果:FACS、Westernblot、Confocal检测提示单层细胞低表达p27,低表达P-gp,而在MCS中p27和P-gp表达明显升高。p27-ASON转染后培养的MCS,p27表达明显下调,同时P-gp表达下调。结论:卵巢癌多细胞球体中P-gp和p27的表达呈相关性,多药耐药性可能和p27的表达上调有关,p27-ASON可下调多细胞球体中P-gp的表达,从而可一定程度的逆转卵巢癌多药耐药性。
- 邢辉李静杨晓葵高庆蕾翁丹卉卢运萍马丁
- 关键词：卵巢癌P27P-GP反义寡核苷酸
- 真核表达survivin基因对曲古菌素A诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响
- 2008年
- 目的探讨survivin基因对曲古菌素A(TSA)诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响。方法(1)将本实验室已构建成功的survivin正义全长真核表达质粒(pcDNA3.1-survivin),经脂质体包裹转染人卵巢癌细胞A2780,以转染pcDNA3.1空载体的A2780细胞为对照。(2)RT-PCR和Western blot方法分别检测survivin mRNA和蛋白质的表达。(3)MTT比色法和流式细胞仪(FACS)分别检测TSA对两组细胞存活率和凋亡率的影响。(4)Western blot检测TSA作用下A2780细胞中survivin蛋白的表达变化。结果(1)RT-PCR和Western blot检测提示转染pcDNA3.1-survivin组中survivin mRNA和蛋白质表达明显高于空载体组。(2)MTT比色法和FACS检测提示转染pcDNA3.1-survivin组细胞存活率明显高于空载体组,细胞凋亡率明显低于空载体组,差异有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3.1-survivin转染后的A2780细胞对TSA的敏感性明显降低。(3)Western blot检测提示survivin的表达水平随着TSA作用时间的延长而下降。结论曲古菌素A诱导卵巢癌细胞的凋亡作用可能与survivin基因表达有关。
- 马晓黎邢辉吴鹏翁丹卉卢运萍马丁
- 关键词：SURVIVIN基因卵巢肿瘤曲古菌素A
- 蛋白酶体抑制剂联合紫杉醇对卵巢上皮性癌细胞药物敏感性的影响被引量：1
- 2008年
- 目的研究蛋白酶体抑制剂波替单抗与紫杉醇单独作用及联合作用于卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞株SKOV3的效果，并对其诱导细胞凋亡的分子机制进行探讨。方法波替单抗与紫杉醇单独或联合（50nmol／L波替单抗、90nmol／L紫衫醇或50nmol／L波替单抗＋90nmol／L紫衫醇）作用于SKOV3细胞后，四甲基偶氮唑蓝比色法测定细胞增殖活性并计算细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，蛋白印迹法检测磷酸化蛋白激酶B（AKT）和磷酸化糖原合成酶激酶3B（GSK-3p）蛋白的表达水平。结果波替单抗与紫衫醇联合作用于SKOV3细胞，12、24、36、48及72h各时间点的细胞存活率分别为（65．2±5．8）％、（58．3±14．4）％、（35．3±5．0）％、（19．2±1．5）％和（11．4±2．5）％，与单用紫杉醇比较，细胞增殖抑制效果增强，各时间点分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。单用紫杉醇、单用波替单抗和两者联用的细胞凋亡率分别为（14．7±0．5）％、（15．1±0．8）％和（20．5±0．7）％，波替单抗与紫杉醇联用的细胞凋亡率明显增高，分别与单用紫杉醇或单用波替单抗比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。不同药物处理细胞后，磷酸化AKT和磷酸化GSK-3B蛋白的表达水平均有不同程度降低，以波替单抗与紫杉醇联用者降低最为明显[分别为（3．2±0．8）％、（19．3±0．4）％]，分别与单用紫杉醇、单用波替单抗、正常未处理细胞比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论蛋白酶体抑制剂波替单抗与紫杉醇联用能增强卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性；AKT／GSK-313信号通路可能在波替单抗与紫杉醇联用诱导细胞凋亡中发挥了重要作用。
- 翁丹卉栗妍孔繁飞范良生胡轶宋晓红邢辉王世宣马丁
- 关键词：肿瘤硼酸化物紫杉酚抗肿瘤联合化疗方案
- 人前列腺癌高低转移细胞株差异表达基因的筛选被引量：2
- 2007年
- 目的:筛选高低转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8和PC3M-2B4间差异表达基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术,对高转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8及其同源低转移细胞株PC3M-2B4进行2次消减杂交,第1次SSH实验,以PC3M-2B4细胞株为实验方,PC3M-1E8株为驱动方,构建正向消减文库。第2次实验则以PC3M-1E8株为实验方,PC3M-2B4为驱动方,构建反向消减文库。筛选出来的阳性克隆进行测序,并在GeneBank数据库中进行同源性比较后从中选取若干序列进行实时定量PCR验证。结果:2个消减文库共得到238个阳性克隆,从中各随机选取8个克隆测序并进行同源性分析,发现其中12条序列来自于11个已知基因,另外4条序列为新的未知功能的基因序列标签(EST)。结论:成功构建了高低转移力人前列腺癌细胞株的双向消减杂交文库。
- 宋安萍廖国宁吴明富卢运萍马丁
- 关键词：前列腺肿瘤肿瘤转移克隆
- 三位点短发卡状RNA在提高RNA干扰效率中的作用被引量：6
- 2008年
- 背景与目的:shRNA技术是近来发展的热点技术之一,但普遍采用的单位点shRNA干扰载体效果并不理想。本研究探讨三位点短发卡状RNA在提高RNA干扰效率中的作用。方法:构建外源基因DsRed全长载体转染HEK293细胞。针对报告基因DsRed设计4个干扰载体,一个含有3段shRNA,另外3个分别含有此3段中1段shRNA。转染293/DsRed,荧光显微镜观察基因DsRed。应用实时定量PCR(Real-timePCR)和流式细胞仪(FACS)检测4个载体对DsRed基因在mRNA及蛋白水平干扰效应。结果:4个载体对靶基因DsRed在mRNA及蛋白水平均有干扰效应,且含有3段shRNA载体对DsRed基因干扰效率为(89±16)%,显著高于3个只含有1段shRNA载体[(50±23)%,(52±15)%,(55±27)%],差异有显著性(P<0.05)。结论:三位点shRNA干扰载体可以提高对靶基因的干扰效率。
- 翁艳洁翁丹卉夏曦宋晓红卢运萍王世宣马丁王常玉
- 关键词：RNA干扰外源基因DSRED短发卡状RNA
- 硼替佐米联合顺铂对卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞化疗敏感性的影响被引量：2
- 2010年
- 目的 研究蛋白酶体抑制剂--硼替佐米联合顺铂作用于卵巢上皮性癌（卵巢癌）顺铂耐药细胞的效果,并探讨其诱导细胞凋亡的分子学机制.方法 实验分组：硼替佐米（50 nmol/L）＋顺铂（40μmol/L）、硼替佐米（50 nmol/L）、顺铂（40 μmol/L）、对照组（未加药物）,以未加药物和细胞,仅加培养基为空白对照（空白组）.采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定各组卵巢癌顺铂耐药细胞株C13细胞培养不同时间（12、24、36、48、60及72 h）后的增殖活性（以细胞存活率表示）,膜联蛋白-碘化丙啶双染色法流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率;并采用蛋白印迹法检测各组细胞内凋亡抑制蛋白短亚型（cFLIPs）蛋白的表达水平,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（caspase-8）活性检测试剂盒检测各组细胞内caspase-8的活性.结果 硼替佐米＋顺铂组细胞显示较好的抑制效果,作用12、24、36、48、60及72 h时其细胞存活率分别为（56.0±8.4）%、（44.7±7.3）%、（33.7±11.2）%、（27.6±8.0）%、（27.6±7.6）%和（28.1±2.4）%,均明显低于顺铂组各时间点（P〈0.05）.作用24 h时,顺铂、硼替佐米、硼替佐米＋顺铂组细胞凋亡率分别为（16.7±l.7）%、（23.4±2.1）%和（26.9±1.6）%,硼替佐米＋顺铂组明显高于顺铂或硼替佐米组（P〈0.05）.各药物处理组细胞内cFLIPs蛋白表达水平均不同程度下降,以硼替佐米＋顺铂组[（43.2±2.3）%]降低最为明显,分别与顺铂、硼替佐米组[分别为（75.7±3.0）%、（67.9±2.1）%]比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.顺铂、硼替佐米和硼替佐米＋顺铂组细胞内caspase-8活性分别为2.3±1.0、4.2±0.9和5.6±1.6,两两比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.结论 蛋白酶体抑制剂--硼替佐米联合顺铂能增强卵巢癌顺铂耐药细胞的化疗敏感性;由药物作用后cFLIPs表达的降低和caspase-8活性的增强推测。
- 粟妍翁丹卉孔繁飞范良生胡轶宋晓红邢辉王薇马丁王世宣
- 关键词：蛋白酶抑制药硼酸化物顺铂抗肿瘤联合化疗方案
- 曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡反义cDNA文库的构建和效应基因的初步筛选被引量：2
- 2009年
- 目的构建曲占霉素A诱导人乳腺癌细胞凋亡反义cDNA文库，以筛选曲古霉素A抗肿瘤的效应基因。方法收集经曲古霉素A处理不同时间点的人乳腺癌细胞MCF-7，提取poly（A）^＋RNA，将逆转录合成的cDNA反向插入载体PCEP4中以构建反义cDNA文库。文库DNA随机转入人宫颈癌细胞HeLa中，以转染PCEP4空载体细胞为对照组，用200nmol／L曲古霉素A和200μg／ml潮霉素同时筛选，至对照组细胞全部死亡，文库组仍有存活细胞时停止曲古霉素A筛选。存活克隆扩增后提取Hirt DNA并转化感受态细胞，获得的转化克隆扩增后进行酶切鉴定并测序，得到多个EST片段，经生物信息学分析后选择感兴趣的EST片段进行初步功能验证。结果构建的反义cDNA文库含有2×10^6重组子，重组效率〉90％；经DNA测序和生物信息学分析提示第27号存活克隆是锌转运蛋白LIV1，该克隆在功能验证时表现出对曲古霉素A非常显著的抵抗效应。结论构建的反cDNA文库容量较大，质量较高；基因LIV1可能是曲古霉素A抗肿瘤的效应基因之一。
- 马晓黎王蓓蓓吴鹏卢运萍周剑锋马丁
- 关键词：乳腺肿瘤反义核酸技术CDNA文库曲古霉素A
