国家自然科学基金(30972921)
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
- 相关作者：诸琦许朝胡端敏曹海霞章永平更多>>
- 相关机构：上海交通大学医学院附属瑞金医院通城县人民医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- EEF1A2基因慢病毒表达载体的构建及慢病毒表达系统的建立被引量：2
- 2013年
- 利用PCR方法合成EEF1A2的基因全长,经NotⅠ和NsiⅠ酶切后克隆到慢病毒载体pGLV5-EF1a-EGFP/Puro上。构建的重组质粒pGLV5/EEF1A2经PCR、酶切及测序鉴定正确后,利用慢病毒表达系统(pGLV5 Lentiviral Expression Systems),将重组质粒与包装系统质粒(pVSV-G,pGag/Pol,pRev)4质粒共转染293T细胞,收集培养上清并感染人胰腺癌SW1990细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株EEF1A2/SW1990。Real-time PCR和West-ern blot检测结果显示EEF1A2在EEF1A2/SW1990细胞中表达较原代细胞明显增高(P<0.05),MTT结果显示EEF1A2/SW1990细胞的增殖能力亦较原代细胞显著增强(P<0.05)。成功构建了EEF1A2基因的慢病毒载体质粒pGLV5-EEF1A2及其慢病毒表达系统,并筛选出稳定过表达EEF1A2的人胰腺癌细胞株EEF1A2/SW1990。
- 许朝胡端敏诸琦
- 关键词：慢病毒载体真核表达
- 生长因子受体结合蛋白2在人类真核翻译延长因子1A2促进胰腺癌发生发展中的作用被引量：2
- 2012年
- 目的明确生长因子受体结合蛋白2（GRB2）在人类真核翻译延长因子1A2（EEFIA2）促进胰腺癌发生发展中的作用。方法用腺病毒质粒Ad5／F35-EEFIA2转染胰腺癌细胞株SW-990（EEF-A2低表达），应用小干扰RNA（siRNA）技术下调胰腺癌细胞BxPC-3（EEF-A2高表达）中EEF-A2的表达水平，用RT—PCR及Western印迹方法检测SW-990和BxPC-3细胞株处理前后GRB2的表达。化学合成GRB2特异高效的siRNA干扰片段，干预胰腺癌细胞BxPC-3后通过MTT和Transwe--实验观察BxPC-3细胞增殖和运动能力的变化。统计学处理采用单因素方差分析。结果腺病毒Ad5／F35-EEF-A2转染人胰腺癌细胞株SW-990后，GRB2的mRNA和蛋白表达水平均明显升高（F-5．67和6．39，P均〈O．05）。EEF-A2-siRNA抑制BxPC-3胰腺癌细胞EEF-A2表达后，GRB2的mRNA和蛋白表达水平均明显下调（F-6．59和4．69，P均〈0．05）。BxPC-3在被转染siRNA—GRB2后，MTT结果显示72h时，siRNA-GRB2组吸光度值为1．22±0．14，与阴性对照组和空白对照组（1．42±0．15和1．39±0．15）相比，差异有统计学意义（F-6．63，P〈0．05）。Transwe--实验结果显示siRNA—GRB2组细胞侵袭能力减弱，24h后穿膜细胞数为（24．10±4．25）个，与阴性对照组[（54．72±5．24）个]及空白对照组E（51．26±6．23）个]相比，差异有统计学意义（F-55．00，P〈0．05）。结论GRB2是EEF-A2促进胰腺癌发生发展的关键分子。
- 胡端敏许朝诸琦
- 关键词：胰腺肿瘤转染
- 静默人类真核延伸因子1A2对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的影响被引量：1
- 2012年
- 目的探讨静默人类真核延伸因子1A2（EEF1A2）对胰腺癌细胞体内生长的影响及其可能的机制。方法建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，均分为空白组、阴性对照组、EEF1A2组，移植瘤内分别注射PBS、阴性对照siRNA和特异性EEF1A2siRNA。测定各组移植瘤的体积和质量；应用免疫组织化学的方法检测各组移植瘤组织中EEF1A2和抗增殖细胞核抗原抗体（PCNA）的表达；应用TUNEL法检测各组移植瘤组织中细胞凋亡率。结果在裸鼠移植瘤模型中，从给药后第17天开始，EEF1A2组移植瘤体积增长明显滞后于阴性对照组和空白组（P值均〈O．05）。治疗结束后切取肿瘤称重，EEF1A2组肿瘤质量为（0．27±0．06）g，显著低于阴性对照组和空白组[（0．39±0．08）g和（O．43±0．07）g，P〈0．05]。EEF1A2主要表达于胰腺癌细胞胞质，其中在阴性对照组和空白组中，阳性细胞分布比较密集，阳性率分别为（72．58±25．47）％和（76．75±23．19）O，而EEF1A2组阳性细胞分布较稀疏，阳性率为（34．78±21．36）％，差异有统计学意义（P〈0．01）。EEFIA2组的PCNA蛋白表达也显著低于空白组和阴性对照组（P〈O．01），而原位末端转移酶标记技术（TUNEL）的结果显示EEF1A2组中细胞凋亡率高于空白组和阴性对照组（P〈0．01）。结论EEF1A2在体内能被有效静默，EEF1A2静默后能明显抑制胰腺癌细胞的生长，可能与其抑制细胞增殖和促进细胞凋亡有关。
- 黄佳黎曙明诸琦曹海霞章永平
- 关键词：胰腺肿瘤RNA干扰细胞凋亡
- 靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2可抑制胰腺癌细胞BxPC-3体外迁移和侵袭被引量：2
- 2012年
- 目的:探讨靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2(homo sapiens eukaryotic translation elongation factor 1alpha 2,EEF1A2)对胰腺癌BxPC-3细胞体外迁移和侵袭的影响及其可能的分子机制。方法:应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测4种胰腺癌细胞株中EEF1A2的mRNA和蛋白表达水平。将EEF1A2-小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和阴性对照siRNA转染到BxPC-3细胞中,随后采用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测EEF1A2的mRNA及蛋白表达,应用体外划痕和Transwell侵袭实验分别检测BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中p-Akt和总Akt蛋白的表达变化。结果:4种胰腺癌细胞株中除SW1990细胞呈EEF1A2低表达外,BxPC-3、Patu8988和Panc-1细胞均呈EEF1A2高表达。EEF1A2-siRNA转染BxPC-3细胞48 h后,EEF1A2 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照siRNA转染的细胞和空白对照细胞明显降低(P<0.01)。EEF1A2-siRNA转染组BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于阴性转染对照组和空白对照组(P<0.05)。EEF1A2-siRNA转染组细胞中Akt的磷酸化水平明显低于对照组细胞(P<0.05),而总Akt蛋白表达水平未显著改变(P>0.05)。结论:siRNA干扰下调EEF 1A 2基因表达可明显抑制胰腺癌BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭,其机制可能与EEF1A2调控Akt信号通路有关。
- 许朝胡端敏诸琦
- 关键词：胰腺肿瘤RNA干扰肿瘤侵润
