国家自然科学基金(30772260)
- 作品数：4 被引量：2H指数：1
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- 相关机构：第四军医大学西京医院武警总医院辽宁医学院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 利用RNAi技术下调VEGF表达对血管瘤内皮细胞的影响被引量：1
- 2011年
- 目的:培养人血管瘤内皮细胞(HemECs),利用RNA干扰技术下调HemECs中VEGF的表达,观察其对血管瘤内皮细胞的影响。方法:利用组织块法培养HemECs,鉴定、筛选和纯化后,分为A、B、C三组,分别为转染组、空脂质体组和对照组。利用脂质体法将pGCsi U6/Neo/dsRED-VEGF真核表达质粒转染到内皮细胞中。通过荧光显微镜大体观察转染效率和细胞生长情况、ELISA法检测细胞分泌VEGF蛋白和MTT法检测质粒转染对HemECs的影响。结果:转染组第五天转染细胞达到总细胞80%以上,但是细胞凋亡逐渐增加。第七天细胞稀少,漂浮死细胞增多。转染阳性细胞减少,细胞整体状态差。转染组培养上清中VEGF蛋白浓度在转染的第1、3、5、7天分别为141.3±7.82、92.34±5.71、68.07±5.95及40.65±6.71pg/ml。MTT法检测各组490nm的OD值在1、3、5、7天均有统计学差异(P<0.05)。结论:转染后的细胞活性降低,通过对其分泌的VEGF蛋白的测量发现,转染组VEGF蛋白明显下降,同时,细胞活力受到影响,漂浮的死细胞增多。这些都可以说明,VEGF在血管瘤内皮细胞生长、增殖之中起着非常重要的作用,这也为我们治疗血管瘤提供一个新的靶点。
- 马戈甲易成刚刘蓓杨力
- 关键词：RNAI血管瘤内皮细胞细胞转染
- 小鼠Mmp-9 shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测
- 2013年
- 目的:设计、筛选、构建并鉴定Mmp-9小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并构建其慢病毒表达载体,为血管化疾病的防治提供理论依据及实验室数据。方法:针对基质金属蛋白酶9靶基因设计siRNA序列,并合成小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,构建成携带Mmp9-shRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-shRNA),PCR及测序鉴定后,Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体,并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP9-shRNA慢病毒,并测定病毒滴度为1×1010pfu/l。结果:PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体,表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体。结论:成功的构建并筛选出针对小鼠Mmp9基因沉默的特异性shRNA重组慢病毒,为血管化性疾病的防治研究提供基础。
- 张冠华易成刚马戈甲杨力
- 关键词：基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒属
- 基因移植人血管内皮细胞生长因子斜备小鼠新生血管模型
- 2011年
- 目的探讨血管内皮细胞生长因子基因用重组慢病毒为载体移植制备新生血管动物模型的可行性。方法构建重组慢病毒介导的人血管内皮细胞生长因子（humanvascularendothelialgrowthfactor，hVEGF165）基因，并转染小鼠成纤维细胞（NIH／3T3）。利用流式细胞仪挑选转染成功的细胞，将转染成功的表达人VEGF165的NIH／3T3细胞植入C57小鼠的骨骼肌，建立小鼠的新生血管模型。在新生血管模型上，用ELISA的方法进行小鼠血清VEGF测定。观察瘤体组织形态学。用免疫组化的方法观察是否有表达CD31的细胞。结果经酶切鉴定、聚合酶链反应（PCR）及基因测序证实Lenti—VEGF165-GFP构建成功，包装后测定滴度为6．19×10^7TU／ml。用基因移植的方法成功建立了稳定的小鼠新生血管模型，并证实小鼠外周血中有VEGF的分泌。14d后细胞植入处局部肿胀。44d后HE染色发现细胞植入部位有血管组织的新生，免疫组化显示有围成规则或不规则管状表达CD31的细胞。结论将表达人VEGF165的NIH／3T3细胞植入C57小鼠的骨骼肌，可以产生稳定有效的新生血管模型。
- 谢芳杨力汤苏阳郑岩易成刚夏炜潘勇马戈甲杨阳
- 关键词：血管内皮细胞生长因子小鼠成纤维细胞
- 稳定表达人VEGF165的NIH/3T3细胞株的筛选与鉴定被引量：1
- 2010年
- 目的培养NIH/3T3细胞,并进行慢病毒载体介导的VEGF165基因转染,为建立转基因小鼠血管瘤模型奠定基础。方法采取贴壁培养法分离培养NIH/3T3细胞,细胞随机分为3组,分别为Lenti-VEGF165-EGFP重组慢病毒载体转染组、Lenti-EGFP慢病毒转染组和未转染组,转染后72h荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪分选后用ELISA方法检测VEGF165外分泌。结果 ELISA检测转染后小鼠NIH/3T3细胞,Lenti-VEGF165-EGFP重组慢病毒载体感染组、Lenti-EGFP慢病毒转染组和未转染组培养上清中VEGF165浓度分别为(205±15)、0、0ng/L(P<0.05) 结论 NIH/3T3细胞获得慢病毒载体介导的VEGF165表达基因修饰且稳定传代,为下一步血管瘤动物模型研究奠定了基础。
- 汤苏阳谢芳杨力郑岩夏炜易成刚陈晓芳
- 关键词：小鼠成纤维细胞VEGF165基因慢病毒转染
