国家自然科学基金(30170436)
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
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- 腺病毒介导HO-1基因转染对大鼠慢性移植肾病预防作用的实验研究被引量：2
- 2006年
- 目的探讨腺病毒介导HO-1基因转染对大鼠慢性移植肾病的预防作用。方法46只大鼠(F34420只,Lewis26只)分为3组:假手术组(Lewis6只,左肾单肾切除)、转空载体组(10只F344供肾给Lewis大鼠,转Ad腺病毒液)、转基因组(10只F344供肾给Lewis大鼠,转Ad-HO-1腺病毒)。术后1、2、3、4周WB法检测肾脏HO-1表达情况,术后4、8、12、16周检测血肌酐含量、术后16周比较大鼠体重、肾脏病理评分,免疫组化染色分析血管平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)及血小板衍生生长因子B(PDGF-B)。结果3组间大鼠体重差异无统计学意义,假手术组血肌酐含量无显著变化,转基因组血肌酐含量升高程度低于转空载体组;HO-1蛋白在转染后1、2周表达最强,3、4周时逐渐减弱;转基因组病理Banff评分显著好于转空载体组;转基因组α-SMA、TGF-β1和PDGF-B表达吸光度值为(1.475±0.044)、(1.494±0.0.63)和(1.589±0.075),显著低于转空载体组。结论重组腺病毒介导HO-1基因转染对大鼠慢性移植肾病具有较好的预防作用,其机理可能与HO-1抑制α-SMA重塑及降低TGF-β、PDGF-B表达、抑制肾脏纤维化有关。
- 戴卫华吴雄飞金锡御
- 关键词：基因转染慢性移植肾病
- 腺病毒介导HO-1基因转染肾小管上皮细胞及对PBMC增殖影响的实验研究被引量：1
- 2006年
- 目的观察Ad-HO-1感染对HK-2细胞存活率的影响,探讨表达目的蛋白血红素氧化酶-1(HO-1)的HK-2细胞能否有效降低外周血单个核细胞(peripheral blood monoeuclear cell,PBMC)增殖反应活性。方法 Ad-HO-1按感染强度(multiplicity of infection,MOI)100、200和400分别转染人肾小管上皮细胞株(HK-2)3 h,转染2 d后观察绿色荧光蛋白的表达,转染2、4 d后进行活细胞计数(台盼蓝染色法)。激光共聚焦法检测HO-1和GFP蛋白在HK-2中的表达,WesternBlot检测HK-2细胞HO-1蛋白表达,3H-TdR法检测HK-2转染后抑制PBMC增殖能力。结果重组腺病毒Ad-HO-1(MOI200)感染HK-2细胞2 d后90%的细胞表达绿色荧光,2、4 d时活细胞百分率与对照组无显著差异。激光共聚焦检测表达GFP的细胞均表达HO-1蛋白,位置分布基本一致。Western blot检测显示HK-2感染Ad-HO-1后有能与HO-1单抗特异性结合的蛋白免疫印迹条带,对PBMC增殖能力有显著抑制作用。结论 Ad-HO-1能介导HO-1目的蛋白的表达,具有抑制PBMC增殖的生物学活性。
- 戴卫华吴雄飞金锡御
- 关键词：血红素氧化酶-1基因转染
- 血红素氧化酶1基因重组腺病毒的构建
- 2005年
- 目的利用细菌内同源重组法构建含血红素氧化酶1基因的重组腺病毒。方法用限制性内切酶XhoⅠ+HindⅢ从克隆载体PRH01中切出血红素氧化酶1基因片段,亚克隆至经SalⅠ+HindⅢ酶切的克隆质粒Puc18中,形成转移质粒Puc18-PRHO1,将之用KpnⅠ+HindⅢ双酶切,再次亚克隆至经同样酶切的质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-Puc18-PRHO1,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒Ad-H01。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果利用CaCl2法由pAdTrack-Puc18-PRHO1和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态菌,可获得阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1.4×1010pfu/ml。结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所制备的重组体腺病毒Ad-H01在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对血红素氧化酶1的深入研究奠定了基础。
- 戴卫华吴雄飞金锡御
- 关键词：腺病毒血红素氧化酶同源重组细菌
- 血红素氧化酶1基因重组腺病毒的构建及感染效率鉴定
- 2005年
- 目的:构建含血红素氧化酶1基因的重组腺病毒及鉴定感染效率。方法:实验于2003-05/2004-06在解放军第三军医大学西南医院消化科实验室完成。①用限制性内切酶XhoⅠ+HindⅢ从克隆载体PRH01中切出血红素氧化酶1基因片段,亚克隆至Puc18中,将之用KpnⅠ+HindⅢ双酶切,再次亚克隆至质粒pAdTrack-巨细胞病毒中,形成转移质粒pAdTrack-Puc18-PRHO1。②将pAdTrack-Puc18-PRHO1PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,得到含目的基因的重组体质粒。③重组腺病毒PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒AdH01。④对重组体腺病毒进行鉴定采用聚合酶链反应方法。结果:①利用氯化钙法由pAdTrack-Puc18-PRHO1和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态菌,可获得阳性重组体细菌克隆。②重组腺病毒基因组DNA,用目的基因血红素氧化酶1引物进行聚合酶链反应检测,可特异性扩增出356bp的预期条带,而空载体组未能扩增出此片段,表明血红素氧化酶1基因已克隆入重组体腺病毒基因组中,根据绿色荧光蛋白记数法测得腺病毒滴度1.4×1013空斑形成单位/L。③重组腺病毒感染效率的测定结果:用浓缩后的重组腺病毒以感染复数为10感染肾小球内皮细胞,约85%的内皮细胞出现荧光,表明腺病毒AdH01在体外能有效表达相应的基因产物。结论:细菌内同源重组法获得AdH01在体外能有效表达。
- 戴卫华吴雄飞金锡御
- 关键词：腺病毒科细菌
