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基于蛋白质反式剪接的双载体凝血Ⅷ因子基因转移被引量：5: 2009年; 以intein的蛋白反式剪接为工具,研究了运用双载体的真核细胞凝血Ⅷ因子（FⅧ）基因转移,通过翻译后剪接得到完整的功能性FⅧ蛋白.将B结构域大部分缺失（Δ761~1639）的人功能性FⅧ（BDD-FⅧ）cDNA于剪接所需保守残基Ser1657前断裂为重链和轻链,分别与106和48个氨基酸的mini Ssp DnaB intein的N端（IntN）和C端（IntC）编码序列融合,构建一对在质粒pcDNA3.1的强启动子CMV驱动下的真核表达载体.用脂质体共转染至293细胞和COS-7细胞,培养48h后,收集细胞上清,用ELISA检测培养上清中剪接形成的BDD-FⅧ蛋白水平,用Coatest法检测上清的功能性FⅧ生物活性,并用Western blot观察细胞内的BDD-FⅧ蛋白质剪接.结果显示,两种细胞培养上清中有较高水平的剪接BDD-FⅧ蛋白形成,分别达到（137±23）和（109±22）ng/mL,由细胞内和细胞外（培养上清）的剪接共同组成并检测到培养上清中较高水平的FⅧ生物活性,分别为（1.05±0.16）和（0.79±0.23）IU/mL,包括细胞内、外剪接产物BDD-FⅧ共同形成细胞总蛋白的Western blot进一步显示共转染后细胞内高效剪接形成的BDD-FⅧ蛋白.表明intein可用于双载体系统真核细胞FⅧ基因转移,并不完全依赖细胞内的剪接产生具有高FⅧ生物活性的BDD-FⅧ蛋白,为进一步在甲型血友病基因治疗研究中应用双腺相关病毒载体（AAV）转运FⅧ基因,克服AAV载体的容量限制提供了依据.; 朱甫祥刘泽隆迟晓艳屈慧鸽刘相钦; 关键词：INTEIN 蛋白质反式剪接

内含肽介导的氯离子通道蛋白CFTR的反式剪接被引量：7: 2009年; 研究利用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能在大肠杆菌中对囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)的反式剪接作用.CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病囊性纤维化(cystic fibrosis,CF).将CFTR的cDNA于剪接反应所需的保守性氨基酸残基Ser660前断裂为N端和C端,分别与split mini Ssp DnaB内含肽的106个氨基酸残基的N端和48个氨基酸残基的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pBV220.诱导表达后SDS-PAGE可见预期大小剪接形成的CFTR蛋白条带,Western印迹用CFTR特异性抗体进一步证明为剪接所产生的CFTR蛋白,表明内含肽可有效催化CFTR的反式剪接.; 朱甫祥刘泽隆屈慧鸽迟晓艳; 关键词：内含肽蛋白质反式剪接

vWF-△Pro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FⅧ基因转移被引量：6: 2010年; 多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除.前肽缺失突变体vWF(vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白.为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响,将vWF-ΔPro基因和融合SspDnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达,用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式,并检测了其对FⅧ的结合力;用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ,并用Coatest法检测由其产生的生物活性.结果显示,vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式,其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近;vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21ng/mL,活性为1.78±0.18IU/mL,明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12ng/mL和1.05±0.13IU/mL),与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19ng/mL和1.95±0.22IU/mL),表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性.为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据.; 朱甫祥杨树德刘泽隆屈慧鸽迟晓艳; 关键词：WILLEBRAND因子内含肽蛋白质反式剪接

大肠杆菌BL21(DE3)中DnaE intein介导ABCA1蛋白的连接: 2009年; 【目的】利用SspDnaEintein的蛋白质反式剪接技术研究在大肠杆菌中对ABCA1基因表达产物的连接作用。【方法】将ABCA1的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys978密码子前断裂为N端和C端两部分,分别与天然存在的反式作用SspDnaEintein的123个氨基酸的N端和36个氨基酸的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)。转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,诱导表达后观察重组蛋白的表达和ABCA1的连接。【结果】转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示预期大小的ABCA1剪接蛋白条带,并进一步为His-Tag抗体进行的Western blotting证实。【结论】结果表明SspDnaEintein可有效催化ABCA1的连接,为进一步研究利用双腺相关病毒(AAV)载体转运ABCA1基因,克服单个AAV载体容量限制进行由ABCA1基因突变所致Tangier病的基因治疗奠定了基础。; 朱甫祥缪静屈慧鸽迟晓艳; 关键词：INTEIN 蛋白质反式剪接 ABCA1

双载体断裂CFTR基因转移及翻译后的连接和功能被引量：3: 2010年; 囊性纤维化跨膜电导调节体(CFTR)基因突变导致一种常染色体隐性遗传病囊性纤维化(CF),利用腺辅助病毒(AAV)载体转运CFTR基因的基因疗法受到AAV载体容量的限制。本文采用intein的蛋白质反式剪接技术,以双载体转运CFTR基因,研究了于其调节结构域(R)断裂成两部分的CFTR基因翻译后的连接及其产生的Cl-通道功能。将人CFTRcDNA于R结构域的Ser712密码子前断裂,构建一对融合SspDna Bintein编码序列的真核表达载体。将这对载体共转染培养的幼年仓鼠肾(BHK)细胞,通过瞬时表达,全细胞和单通道膜片钳记录Cl-电流,并用Westernblotting观察CFTR蛋白的剪接。结果表明,共转染细胞显示较高的全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性,说明CFTR的Cl-通道功能的恢复,用CFTR特异性抗体进行的细胞总蛋白Westernblotting显示有完整的CFTR蛋白条带形成,表明intein可有效连接翻译后的两部分CFTR蛋白。结果提示,蛋白质剪接技术可有效用于双载体系统转运CFTR基因,为进一步应用双AAV载体转运CFTR基因的CF基因治疗研究提供了实验依据。; 朱甫祥刘泽隆屈慧鸽迟晓艳; 关键词：蛋白质反式剪接氯离子通道

糖基化修饰促进内含肽剪接的凝血因子Ⅷ的分泌和活性被引量：3: 2010年; 目的观察糖基化修饰对内含肽剪接的B区缺失型凝血因子Ⅷ（BDD-FⅧ）分泌的影响.方法将含有6个潜在的天冬酰胺糖基化位点（N6）的FⅧ的B区226个氨基酸引入BDD-FⅧ重链,用双载体转融合内含肽的此重链和轻链基因（N6HCIntN和IntCLC）至培养的293细胞,用酶联免疫吸附试验（ELISA）和Coatest发色法分别检测基因共转染细胞分泌至培养上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和凝血生物活性.结果共转染N6HCIntN和IntCLC基因细胞上清中BDD-FⅧ蛋白浓度为（123±18）ng/ml,凝血活性为（0.94±0.11）U/ml,明显高于共转染内含肽融合的无糖基化修饰重链（HCIntN）和IntCLC基因细胞上清的BDD-FⅧ蛋白浓度[（86±12）ng/ml]和凝血活性[（0.65±0.07）U/ml,均P＜0.05].分别转染N6HCIntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和凝血活性[（18±6）ng/ml,（0.15±0.05）U/ml].结论糖基化修饰可促进内含肽剪接的BDD-FⅧ的分泌并表现出不依赖细胞机制的蛋白质剪接功能.; 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳; 关键词：糖基化蛋白质剪接内含肽

Ssp DnaB intein大肠杆菌中介导FVIII重链和轻链的连接被引量：7: 2009年; 研究利用intein的蛋白质反式剪接功能在大肠杆菌中对凝血VIII因子(FVIII)重链和轻链的连接作用,将B结构域大部分缺失型FVIII(BDD-FVIII)于满足剪接所需的保守性氨基酸Ser1657前断裂为重链和轻链,分别与split mini Ssp DnaB intein的106个氨基酸的N端(Int-N)和48个氨基酸的C端(Int-C)融合,构建到原核表达载体pBV220。诱导表达后SDS-PAGE分析可见预期大小的BDD-FVIII蛋白条带,Western blotting用FVIII特异性抗体证明其为剪接所产生的BDD-FVIII蛋白,表明intein可有效连接BDD-FVIII的重链和轻链。为进一步甲型血友病基因治疗研究应用intein以双腺相关病毒载体(AAV)携带FVIII基因,克服单个AAV载体的容量限制提供了依据。; 朱甫祥刘泽隆屈慧鸽辛晓林董洪新刘相钦

vWF促进intein剪接的BDD-FVⅢ的分泌和活性被引量：3: 2010年; vWF是由巨核细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白,其主要功能之一为凝血VIII因子(FVIII)的载体,防止后者被血浆酶降解。作者最近的工作证明intein可应用于双载体转移B结构域缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,通过翻译后的蛋白质反式剪接形成完整的功能性BDD-FVIII蛋白。为了研究vWF对于intein连接的BDD-FVIII分泌和活性的影响,通过intein融合的BDD-FVIII重、轻链基因和vWF基因共转染培养的293细胞,采用ELISA观察了分泌至培养上清液中的由intein剪接的全长BDD-FVIII抗原量,并用Coatest检测了由其产生的活性。结果显示,vWF基因共转染细胞上清液中,全长BDD-FVIII抗原量为(235±21)ng·mL-1,活性为(1.98±0.2)u·mL-1,明显高于未转染vWF的细胞[(110±18)ng·mL-1和(1.10±0.15)u·mL-1],也明显高于单独转染BDD-FVIII基因的对照细胞[(131±25)ng·mL-1和(1.22±0.18)u·mL-1],表明vWF基因共转染可显著改善双载体转BDD-FVIII基因后intein剪接的BDD-FVIII蛋白的分泌和生物活性。为基于蛋白质剪接的断裂BDD-FVIII基因转移的甲型血友病基因治疗研究中,应用vWF基因共转移以提高治疗的功效提供了依据。; 朱甫祥杨树德刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳; 关键词：WILLEBRAND因子凝血VIII因子分泌 INTEIN

蛋白反式剪接的人/猪嵌合体BDD-FVIII及其分泌的改善: 2010年; 本研究采用具有促分泌作用的猪FVIII分子的A1和A3区,替换人FVIII分子的相应结构,构建人/猪嵌合体BDD-FVIII(BDD-hpFVIII),利用Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接功能,双载体培养的COS-7细胞瞬时共转嵌合体BDD-hpFVIII基因。免疫印迹法观察了转基因细胞内的蛋白表达和BDD-hpFVIII的剪接,采用ELISA和Coatest法分别观察了分泌至培养上清液中剪接的嵌合体BDD-hpFVIII蛋白和生物活性。结果显示,基因共转染细胞内可见明显的剪接BDD-hpFVIII蛋白,分泌至上清液的剪接BDD-hpFVIII蛋白量为(340±64)ng·mL-1,活性为(2.52±0.32)u·mL-1,明显高于双载体共转人BDD-FVIII基因细胞[质量浓度为(93±22)ng·mL-1,活性为(0.72±0.13)u·mL-1],提示intein介导的双载体共转BDD-hpFVIII基因可明显促进剪接蛋白的分泌。另外,分别转intein融合BDD-hpFVIII重链和轻链基因的细胞混合培养后上清液中仍可检测到剪接的BDD-hpFVIII蛋白及其活性,分别为(44±9)ng·mL-1和(0.32±0.07)u·mL-1,提示intein可进行不依赖细胞机制的BDD-hpFVIII剪接。本研究为旨在提高分泌的动物体内应用intein的双载体转BDD-hpFVIII基因奠定了基础。; 朱甫祥杨树德刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳; 关键词：分泌蛋白质反式剪接

双Intein介导3片段vWF的反式剪接被引量：4: 2010年; von Willebrand因子(vWF)基因突变导致血管性血友病(VWD),由于其基因过大在基因治疗研究中难以为多数病毒载体携带.利用双内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能研究断裂成3段的vWF基因分别表达后在蛋白水平的连接,旨在为vWF基因的3载体联合转移应用于VWD基因治疗研究提供依据.将vWF cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段(N、M和C),分别与splitSspDnaE intein的N端(En)、C端(Ec)和splitSspDnaB intein的N端(Bn)、C端(Bc)编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)中的His-Tag的下游,得到3种表达载体pET-NEn、pET-EcMBn和pET-BcC.分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE分析融合蛋白的表达,并进一步用His-Tag的特异性抗体进行分析;亲和层析纯化分别表达的带His-Tag标签的3段蛋白,复性后体外混合进行剪接实验以观察3片段vWF的连接.结果显示,3段预期大小的融合intein的vWF蛋白均有表达,用His-Tag抗体进行的Western印迹得到进一步证实;3段纯化的蛋白混合后可见明显的剪接条带形成,与vWF的预期分子量大小一致,表明双intein通过蛋白质反式剪接可有效连接3个片段的vWF,为进一步应用蛋白质剪接技术的3重载体真核细胞转vWF基因奠定了基础.; 朱甫祥郭猛刘泽隆屈慧鸽迟晓艳; 关键词：内含肽蛋白质反式剪接 WILLEBRAND因子

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