国家科技支撑计划(2006BAD06A15)
- 作品数：19 被引量：22H指数：3
- 相关作者：舒跃龙张昕安小平周育森张宝中更多>>
- 相关机构：军事医学科学院中国疾病预防控制中心北京中亚国瑞生物经济研究所更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学交通运输工程更多>>
- 甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单抗杂交瘤细胞株的制备与初步鉴定被引量：2
- 2010年
- 目的:建立具有高特异、高效价的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单抗的杂交瘤细胞株。方法:以纯化的昆虫杆状病毒表达的甲型H1N1流感病毒HA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blot分析单抗的特性和特异性。结果:获得6株甲型H1N1流感HA抗原特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗原肽库ELISA检测结果表明其中3株(1E12,3F12,1C11)单抗只与甲型H1N1流感HA抗原肽库反应,不与H5N1病毒HA抗原肽库反应;Western blot分析表明,单抗1B3只特异识别甲型H1N1流感HA抗原,而与其他季节性甲流病毒(H1,H3)及人禽流感H5N1病毒不反应。结论:所获杂交瘤细胞株特异性强,效价高,分泌抗体性能稳定,为分析甲型H1N1流感病毒抗原性位点、建立诊断试剂奠定了基础。
- 王慧娟张陵林周为民谭文杰许洪林王文玲周剑芳舒跃龙阮力
- 关键词：单克隆抗体
- 多重RT-PCR结合反向杂交技术检测多种流感病毒方法的研究
- 2010年
- 目的 建立一种基于多重RT-PCR结合反向斑点杂交技术的多种流感病毒核酸快速检测方法.方法 对5种亚型流感病毒的HA基因序列进行比对分析,选择合适的保守区域设计引物序列,并在扩增产物序列内部选择高变区设计探针序列.首先,使用生物素标记的引物扩增出同样带标记的PCR产物;然后,产物与膜上的探针杂交,通过生物素-亲和素反应,最后以斑点显色的方式来检测和鉴别不同亚型的流感病毒.实验中还通过摸索不同的引物浓度和探针浓度来优化反应条件.结果 成功建立了一种基于多重RT-PCR结合反向斑点杂交技术的检测方法,该方法能够成功检测和鉴别5种不同亚型的流感病毒,检测灵敏度比传统的RT-PCR方法高100～1000倍.结论 成功建立了一种可高通量快速检测多种流感病毒的多重RT-PCR结合反向斑点杂交技术的检测方法.
- 杨亮张晓梅张晓光马晶王敏温乐英王大燕白天舒跃龙钱永华曾毅
- 关键词：聚合酶链反应杂交流感
- 利用DREAM设计和同源重组进行一步定点突变被引量：5
- 2008年
- 目的:建立基于DREAM设计和同源重组的简便、快速定点突变方法。方法:设计两条包含突变的反向PCR(inverse PCR)引物,使其5′端互补从而产生同源重组,同时使用DREAM设计方案在上述引物中引入限制性内切酶位点以便突变子筛选。用能扩增长片段的高保真耐热DNA聚合酶扩增全长的质粒DNA,直接转化大肠杆菌。转化到细菌中的全长质粒DNA PCR产物可利用其末端同源序列发生同源重组而环化。利用引入的酶切位点方便地进行突变子的筛选。结果:用该方法成功地对长度大于7kb的质粒进行了定点突变。结论:本定点突变无需任何突变试剂盒和特殊的试剂,只需一步反应即可完成;利用DREAM设计使克隆筛选简便可靠,高保真耐热DNA聚合酶可保证多数突变子克隆不发生意外突变,而该酶扩增长片段的能力使该方法适合于大多数质粒不经亚克隆直接突变。
- 张宝中冉多良刘大斌王盛张昕安小平周育森童贻刚
- 关键词：定点突变同源重组
- 抗H5N1病毒嵌合IgA抗体基因的构建及其在CHO细胞中的表达被引量：1
- 2009年
- 为了表达具有中和活性的抗禽流感H5N1病毒人-鼠嵌合IgA抗体,采用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗禽流感H5N1-HA鼠源单克隆抗体的轻重链可变区基因及相应的信号肽编码序列,分别与人免疫球蛋白IgA2重链恒定区、Kappa恒定区基因拼接,构建表达质粒pEF-IGHA9和pEF-IGK9,共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO(CHO-dhfr-)细胞,用ELISA检测培养上清中嵌合IgA抗体的表达,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western blotting印迹分析。结果成功地在CHO细胞中表达了抗禽流感H5N1病毒人-鼠嵌合IgA抗体,为制备抗H5N1重组分泌型IgA预防性抗体制剂奠定了良好的基础。
- 张宝中张昕陈万荣刘大斌王盛安小平冉多良赵光宇周育森童贻刚
- 关键词：H5N1病毒免疫球蛋白基因CHO细胞
- 含H5N1-HA基因重组腺病毒疫苗的构建及其诱导免疫应答的初步探讨
- 2009年
- 目的构建包含H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗并探讨其免疫效果。方法用Admax系统构建包含H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗，并用PCR、Western—Blot等方法对重组病毒疫苗进行鉴定；疫苗免疫小鼠后，通过H1实验和ELISPOT实验检测其体液免疫和细胞免疫反应，评价其免疫效果。结果成功得到了含有H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗；基因表达鉴定表明，HA基因能够在细胞中进行表达；血凝抑制实验结果显示小鼠产生的针对HA抗体滴度在1：320和1：640之间；ELISPOT结果显示实验组和对照组（PBS）相比斑点数量差异有统计学意义（P〈0．05），以上免疫结果表明重组腺病毒载体疫苗可以诱导小鼠产生良好的特异性体液和细胞免疫反应。结论含H5NA—HA的重组腺病毒疫苗可以诱导小鼠产生良好的免疫反应，为研制人禽流感疫苗打下基础。
- 张晓光李魁彪马晶王乃福张晓梅桑云虎董婕徐红曾毅
- 关键词：流感病毒A型流感病毒A型腺病毒疫苗
- 流感病毒H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达
- 2010年
- 目的克隆、表达和鉴定流感病毒H3N2血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆流感病毒H3N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(52 bp～1 549 bp)、pMET A/NA(121 bp～1 260 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了流感病毒H3N2 HA、NA基因序列,为流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗开发等进一步研究奠定了基础。
- 李梓张烨唐启慧陈禹宝于在江辛丽陈永坤陈清轩舒跃龙
- 关键词：血凝素神经氨酸酶酵母菌
- 禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶因在大肠杆菌中的表达
- 2010年
- 克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短)、pET32a(+)/NA(截短)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2 HA、NA基因序列。为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。
- 张烨于在江辛丽陈永坤唐启慧陈禹保陈清轩舒跃龙
- 关键词：血凝素神经氨酸酶克隆表达
- 精制马抗H5N1禽流感病毒免疫球蛋白疏水层析方法的优化被引量：1
- 2010年
- 目的对精制马抗H5N1禽流感病毒免疫球蛋白疏水层析方法进行优化。方法将胃蛋白酶直接加入制备好的高效价马抗H5N1禽流感病毒血清进行消化裂解,再加入饱和度为26%的硫酸铵溶液,盐析沉淀离心一次后,直接进行疏水层析进一步纯化F(ab′)2抗体。结果连续洗脱依次出现6个蛋白峰,50min左右,洗脱峰3开始出现,其中含大部分F(ab′)2抗体,此时硫酸铵摩尔浓度约为1.0～1.1mol/L。阶段梯度洗脱,当硫酸铵摩尔浓度降至1.0mol/L时,大量F(ab′)2片段被洗脱下来,纯度达90%以上。结论优化了精制马抗H5N1禽流感病毒免疫球蛋白的疏水层析方法,降低了硫酸铵用量,减少了离心次数,生产周期也大大缩短。
- 刘冰王承宇杨松涛高玉伟王铁成夏咸柱
- 关键词：流感病毒A型H5N1亚型免疫球蛋白疏水层析
- 流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在酵母菌中的表达被引量：3
- 2010年
- 在成功克隆流感病毒H1N1全长HA（Hemagglulinin，HA）、NA（Neuramidinase，NA）基因并测序的基础上，将部分基因序列克隆到表达载体pMETA上，构建了重组表达质粒pMETA/HA（52～1557bp）、pMETA／NA（121～1263bp），电转化真核酵母菌pMAD16，甲醇诱导表达，利用Ni^2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。SDS-PAGE显示重组蛋白在酵母菌中可以高效表达，蛋白纯度占总蛋白的95％以上，ELISA和Western blotting实验证实，重组蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表达了流感病毒H1N1HA、NA基因序列，为流感病毒H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了参考。
- 张烨于在江辛丽陈永坤唐启慧陈禹保陈清轩舒跃龙
- 关键词：血凝素神经氨酸酶酵母表达
- 禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达被引量：2
- 2010年
- 目的:克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法:在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMETA上,构建了重组表达质粒pMETA/HA(52～1545bp),pMETA/NA(121～1254bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果:重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2HA、NA基因序列,为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。
- 张烨于在江唐启慧陈禹保辛丽陈永坤陈清轩舒跃龙
- 关键词：血凝素神经氨酸酶
