国家自然科学基金(30872950)
- 作品数：26 被引量：66H指数：5
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- 小鼠肝肿瘤细胞原位灌注分离培养方法的建立被引量：1
- 2015年
- 目的建立一种有效分离小鼠肝肿瘤细胞的原代培养方法,为肝癌发生发展的机制研究提供有效的实验手段。方法以9月龄H-ras12V转基因肝癌小鼠为实验材料,采用传统的小鼠肝细胞原代培养的灌注分离法,并对其进行改进,即在灌注的同时,用剪刀剪去肿瘤表面阻塞的血管和组织,疏通灌注液流,达到有效消化肿瘤组织的目的。对用此改良灌注法分离的肝肿瘤细胞和肿瘤周围组织细胞进行成活率计数,并进行后续的原代细胞培养,观察第3、5、7天的细胞生长状态和形态特征。结果通过对传统的灌注分离肝细胞法进行改良,分离的肝肿瘤细胞成活率由未改良前的10%提升到40%。原代培养的结果表明,分离的肝肿瘤细胞与肝肿瘤周围的正常肝细胞的形态和随时间延长的凋亡变化状态没有显著差异。结论改良的灌注法能够有效的分离小鼠肝肿瘤细胞,并显著提高其存活率和细胞质量,可用于后续的原代细胞培养并开展相关的实验。另外,本文对改良灌注法的详细叙述也为相关的科研工作者提供了切实可行的操作规程。
- 李学凤陈军庄云芳董建一李慧玲王福金王爱国王靖宇
- 关键词：肝肿瘤原代细胞培养
- 一种简便、高效的实时荧光PCR相对定量方法的建立被引量：5
- 2012年
- 目的建立一种简便、高效的实时荧光PCR相对定量方法。方法采用严格一致的引物参数,对Fabp5、Ppar-α及β-Actin三个基因分别设计特异性扩增引物,制备相应的质粒标准品,10倍梯度稀释后制作标准曲线。并以这三个标准曲线分别单独定量正常小鼠肝组织、H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤周围组织和肿瘤组织中的Fabp5、Ppar-α和β-Actin的表达水平,以β-Actin为内参,分别采用双标准曲线法、2-△△Ct法和单标准曲线法对Fabp5和Ppar-α的表达进行相对定量分析。结果单标准曲线法与双标准曲线法测定的Fabp5和Ppar-α差异性表达的相对定量值没有显著差异,而用2-△△Ct法获得的相对定量值与双标准曲线法相比,波动较大。结论在引物参数严格一致的基础上,单标准曲线法是一种可行、简便、高效的实时荧光PCR相对定量方法。
- 陈军王银李慧玲董建一王福金王爱国王靖宇
- 关键词：实时荧光定量PCR
- 利用肝癌小鼠动物模型改进临床生物化学与检验实验的研究被引量：1
- 2011年
- 目的增加学生对《赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)》实验的学习兴趣。方法利用赖氏法测定Ras转基因肝癌小鼠与对照组小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性,以提高学生的认识和教学效果。结果 Ras转基因肝癌小鼠的血清ALT活性显著高于对照组小鼠。结论利用肝癌小鼠动物模型改进临床生物化学与检验实验,实验结果较为理想,增加了学生学习的主动性,提高了教学效果,可予推广应用。
- 王银李坤张雪莲王爱国
- 关键词：肝癌小鼠丙氨酸氨基转移酶赖氏法
- ras癌基因诱导小鼠肝肿瘤发生及脂质代谢紊乱被引量：2
- 2013年
- 目的探究ras癌基因在肝细胞中特异性表达对肝肿瘤发生及脂质代谢的影响。方法采集6～8月龄H-ras 12V转基因雄鼠的肝组织和血清,分别进行肝组织病理学检测和血清ALT、总胆固醇及甘油三酯水平的检测。结果 7月龄雄性转基因小鼠100%发生了肝肿瘤。病理学和血清学检测表明,与野生型小鼠相比,转基因小鼠的肝脏,特别是肝肿瘤,发生了显著的脂肪变性;转基因小鼠的ALT、总胆固醇水平显著升高,甘油三脂水平显著下降。结论 ras癌基因在肝细胞中的特异性表达诱导了肝肿瘤发生、肝细胞损伤和脂肪变性,并显著影响机体的脂质代谢。
- 武艳霞董建一李慧玲汤莉王爱国王靖宇
- 关键词：RAS癌基因肝癌脂质代谢
- AngioSense~ 750EX和Hypoxisense 680对体内肿瘤新生血管和缺氧微环境荧光成像效果检测被引量：3
- 2015年
- 目的检测以新生血管渗漏区域为靶标(AngioSense○R 750EX,Ang750)和以缺氧肿瘤细胞表面的碳酸酐酶9为靶标Hypoxisense 680,Hyp680两种新试剂对活体肿瘤的荧光成像效果。方法应用Ang750和Hyp680两种荧光试剂分别对原发性肝肿瘤小鼠(H-ras12V转基因肝癌小鼠)、腋下移植瘤小鼠(S180,HepG2,H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤组织)、以及背部皮下移植瘤小鼠(S180)进行活体成像,观察这两种试剂对活体肿瘤新生血管和缺氧微环境的指示效果。结果对于原发性肝肿瘤,Ang750试剂可在尾静脉注射后6h对肝肿瘤新生血管进行有效的指示,12h达到最佳检测效果。对于腋下移植瘤,Ang750试剂分别在尾静脉注射后10和6h对S180移植瘤及HepG2和H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤组织的移植瘤的新生血管进行有效指示,24h达到最佳检测效果。对于背部皮下移植瘤,Ang750试剂可在尾静脉注射后10h对S180移植瘤新生血管进行有效的指示,24h达到最佳检测效果,但其荧光强度显著低于原发性肝肿瘤和腋下移植瘤。Hyp680试剂不能对本实验中活体肿瘤的缺氧微环境进行有效指示。结论以新生血管为靶标的荧光指示剂Ang750能够对体内肿瘤新生血管微环境进行有效的指示,但不能有效确认相邻近多发性肿瘤的大小和个数。以缺氧为靶标Hyp680对体内肿瘤缺氧微环境的指示作用没有普适性。
- 赵明媛宋雅楠高文婷王福金王爱国王靖宇
- 关键词：肿瘤新生血管缺氧
- 肝肿瘤线粒体功能障碍及抗氧化应激机制的探讨被引量：2
- 2015年
- 目的 :探讨癌基因Ras诱导小鼠肝组织中线粒体功能的障碍及肝肿瘤细胞抗氧化应激反应的分子作用机制。方法 :采集H-ras12V转基因雄性小鼠的肝癌组织、癌旁组织以及正常健康雄性小鼠的肝组织(正常对照)。采用比色法定量检测肝组织中线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活性;对线粒体呼吸链相关基因的转录组进行测序,并采用实时荧光定量PCR法检测组织中线粒体复合物关键酶NADH脱氢酶(辅酶)1α亚基12[NADH dehydrogenase(ubiquinone)1 alpha subcomplex 12,Ndufa12]、NADH脱氢酶(辅酶)铁硫蛋白6[NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein 6,Ndufs6]、泛醌细胞色素C还原酶结合蛋白(ubiquinol-cytochrome C reductase binding protein,Uqcrb)和细胞色素C氧化酶7a2(cytochrome C oxidase subunitⅦa polypeptide 2,Cox7a2)m RNA的表达水平以及Bcl-2和解偶联蛋白2(uncoupling protein2,Ucp2)m RNA的表达水平;免疫荧光法检测组织中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量。结果 :与正常健康雄性小鼠肝组织相比,H-ras12V转基因雄性小鼠肝癌组织和癌旁组织中线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活性均显著降低(F=14.26,P=0.003);转基因小鼠肝癌组织和癌旁组织中Ndufa12、Ndufs6、Uqcrb和Cox7a2 m RNA的表达水平均显著降低(F=18.55,P=0.001;F=7.06,P=0.014;F=12.81,P=0.002;F=10.51,P=0.004)。免疫荧光检测结果显示,与正常对照组和转基因小鼠肝癌组织相比,转基因小鼠癌旁组织中ROS的水平显著升高(F=31.35,P=0.001);Bcl-2和Ucp2m RNA表达水平均显著升高(F=20.29,P=0.002;F=15.51,P=0.001)。结论 :癌基因Ras的表达直接下调了肝组织线粒体呼吸链复合物关键酶的表达,进而导致线粒体功能障碍并上调细胞内ROS的水平。肝癌细胞通过促进Bcl-2和Ucp2的表达降低线粒体产生的ROS,进而促进肝癌的发生和发展。
- 庄云芳李慧玲姚亮崔海鹏董建一陈军王福金王爱国王靖宇
- 关键词：活性氧
- 简易高效的小鼠肝再生模型的建立被引量：1
- 2012年
- 目的建立一种简易、高效的小鼠2/3肝切除方法。方法取3月龄健康昆明小鼠,进行肝顺次结扎切除手术,观察术后小鼠生存和肝组织再生状况。结果通过顺次结扎切除左小叶和中央小叶,可在15min内完成小鼠2/3肝脏切除手术,术后成活率为90%,术后42h时可见肝组织再生,术后7d肝脏可恢复75%以上的肝组织原质量。结论通过分叶顺次肝切除术,可准确量化肝脏切除的程度,简便易行、成功率高,为肝再生的机理研究提供了理想的动物模型。
- 汤莉杨超尹蕾边富宁王晓璐高智勇王爱国
- 关键词：小鼠
- H-ras12V促进肝肿瘤细胞脂肪变性机制探讨被引量：2
- 2015年
- 目的探讨固醇调节元件结合蛋白1c(transcription factor sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)在Ras癌基因诱导小鼠肝肿瘤细胞脂肪变性中的作用机制。方法采集9个月龄C57BL/6J小鼠(12只)正常肝组织(Wt)和H-ras12V转基因小鼠(12只)的肝肿瘤组织(T)及其周围组织(P),并用病理学方法进行确诊检测。酶偶联比色法检测组织样本中的甘油三酯含量,蛋白质印迹法检测磷酸化的磷脂酰肌醇3激酶(phosphorylation ofphosphatidylinositol-3kinase,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylation of protein kinase B,p-AKT)及SREBP-1c的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR法检测SREBP-1c靶基因乙酰辅酶A羧化酶a(acetyl-CoA carboxylase a,ACACa)、乙酰辅酶A羧化酶b(acetyl-CoA carboxylase b,ACACb)、硬脂酰辅酶A脱氢酶(stearoyl-CoA desaturase1,SCD1)及脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASn)基因的mRNA表达水平。结果正常肝组织和周围组织未发生组织病理学变化,肝肿瘤组织与周围组织边界清楚,肝肿瘤组织中的肿瘤细胞分化良好并伴有大泡性脂肪变性。与病理结果相一致,与正常肝组织(1±0.29)及转基因小鼠肝肿瘤周围组织(0.78±0.18)相比较,转基因小鼠肝肿瘤组织中的甘油三酯含量(2.14±0.15)显著增高,P值均<0.001,差异有统计学意义。转基因小鼠肿瘤周围组织与正常肝组织中的甘油三酯含量差异无统计学意义,P=0.092。蛋白质印迹法检测结果表明,与正常肝组织相比,p-PI3K在P和T中呈逐步升高趋势,且差异有统计学意义,P<0.05;与正常肝组织相比,p-AKT和AKT在周围组织和肝肿瘤组织中呈升高趋势,但仅肝肿瘤组织中的p-AKT差异有统计学意义,P=0.028;与正常肝组织及周围组织相比,肝肿瘤组织中的SREBP-1c前体蛋白及成熟体蛋白的表达水平均显著升高,P值均<0.001。实时荧光定量PCR检测结果显示,ACACb和SCD1在正常肝组织、周围组织及肝肿瘤
- 李学凤陈军赵文王福金王爱国王靖宇
- 关键词：固醇调节元件结合蛋白肝肿瘤细胞脂肪变性
- 原代培养对成年小鼠肝组织及肝癌组织理化特性的影响
- 2017年
- 目的探讨体外培养对成年小鼠肝组织及肝癌组织理化特性的影响。方法采取9月龄H-ras12V转基因雄性小鼠的肝癌组织和癌旁组织及C57/BL6J正常雄性小鼠的正常肝组织进行体外培养,苏木精-伊红染色法检测肝组织在12 d内的生长状态;考马斯亮蓝染色法检测组织中总体蛋白在48 h内的变化趋势;Western blot法检测48 h内培养组织中p-ERK、p-AKT、p-mTOR、GAPDH和Cyclin D1的蛋白表达水平;RT-qPCR法检测48 h内培养组织中18s RNA、Cyclin D1、GAPDH、UQCRB的mRNA表达水平。结果体外培养6 d内,正常雄性小鼠肝组织、H-ras12V转基因雄性小鼠肝癌及癌旁组织的细胞形态变化相似,存活状态良好。体外培养6 d后,正常肝细胞和癌旁细胞逐渐减少,相比之下,肝癌细胞开始出现大量死亡,但出现少数克隆样细胞团。考马斯亮蓝染色检测结果显示,正常肝组织、肝癌组织和癌旁组织的总体蛋白变化趋势相似,随培养时间的延长,在130~170 k D之间的蛋白条带丰度先升高再降低,40~130 k D之间的蛋白条带丰度逐渐增加。Western Blot检测结果显示,随着体外培养时间的延长,组织中p-ERK、p-AKT、p-mTOR、GAPDH和Cyclin D1的蛋白表达水平呈逐渐下降趋势。RT-qPCR检测结果显示,Cyclin D1在正常肝细胞、肝癌细胞及癌旁细胞和GAPDH在正常肝细胞、癌旁细胞中随培养时间的延长,呈现逐级升高趋势;而GAPDH在肝癌细胞和UQCRB在正常肝细胞、肝癌细胞及癌旁细胞中随培养时间的延长,呈现先下降后又逐渐升高的趋势;18s RNA的mRNA表达水平在正常肝细胞、肝癌细胞及癌旁细胞中没有规律性趋势变化。结论成年小鼠肝组织及肝癌组织在体外培养期间,虽然肝细胞的形态学变化不明显,存活良好,但短时间内,众多基因在mRNA和蛋白的表达水平上发生了显著的变化,对实验结果将有较大的影响。
- 庄云芳樊婷婷童仁洋李学凤李慧玲王福金王爱国王靖宇
- 关键词：肝组织肝癌组织成年小鼠
- 低磁场核磁共振对小鼠原发性和移植性肿瘤的成像效果被引量：4
- 2015年
- 目的利用小鼠原发性和移植性肿瘤模型检测0.5T低磁场小动物核磁共振(MRI)的成像效果。方法采用0.5T低磁场MRI仪对小鼠皮下移植瘤(Hep G2、S180、H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤组织)和原发性肝肿瘤(H-ras12V转基因肝癌小鼠)进行检测,观察其影像学表现并对H-ras12V转基因小鼠原发性肝肿瘤进行病理学确认。结果皮下移植瘤小鼠(S180、Hep G2、H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤组织)的肿瘤生长状态良好,肉眼及X光检测均可观察到显著的肿瘤团块。MRI成像结果表明,皮下肿瘤部位的T1WI上表现为低信号、T2WI上表现为高信号、成像清晰、效果良好,且三种小鼠皮下移植瘤的MRI成像效果相似。对于H-ras12V转基因小鼠原发性肝肿瘤的MRI成像结果表明,在转基因小鼠的肝区出现了T1WI上表现为低信号的多个区域,这些相应区域在T2WI上表现为高信号。病理解剖及病理切片证实,这些区域为多发性肝肿瘤。结论利用低磁场MRI可以对小鼠原发性肝肿瘤和移植性肿瘤进行有效的检测,可作为小鼠肿瘤无创检测的有效方法。
- 赵明媛高文婷宋雅楠王福金王爱国王靖宇
- 关键词：成像效果肿瘤
