国家自然科学基金(81173137)
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
- 相关作者：郑智慧赵宝华路新华张雪霞董爱华更多>>
- 相关机构：河北师范大学华北制药集团新药研究开发有限责任公司四川大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金“重大新药创制”科技重大专项国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人单酰基甘油脂肪酶基因的克隆表达、纯化及活性研究被引量：1
- 2012年
- 目的人单酰基甘油脂肪酶(human monoacylglycerol lipase,MAGL)是一类促进脂肪分解成甘油和脂肪酸的丝氨酸水解酶,是抗肿瘤药物研发的新靶点。为了建立高通量的MAGL抑制剂筛选模型,本研究对人MAGL进行了基因克隆、体外重组表达、纯化以及活性研究。方法通过RT-PCR方法从人脑总RNA中扩增人MAGL基因,并将该基因克隆入pET28a(+)表达载体。将重组蛋白在E.coli BL21(DE3)宿主菌中通过1mmol/L IPTG诱导表达。表达产物用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行分离纯化,通过SDS-PAGE进行分析。以7-hydroxycoumarinyl arachidonate(7-HAC)为荧光底物进行酶的活性测定。结果成功扩增出人MAGL基因,并构建了pET28a-MAGL表达载体。SDS-PAGE检测结果表明重组人MAGL蛋白在宿主菌中的表达量可达菌体总蛋白量的25%,经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱分离纯化后的重组蛋白纯度大于90%,其比活力达到7900IU/mg,,较纯化前提高了23倍。酶活性分析结果证明重组表达并纯化的蛋白具有单酰基甘油脂肪酶活性,另外,利用已知的MAGL抑制剂N-arachidonylmaleimide(NAM)对该酶表现出强的抑制活性,IC50值为0.53μmol/L。结论本研究成功利用大肠埃希菌原核表达体系重组表达并纯化了人单酰基甘油脂肪酶,为建立以MAGL为靶点的抗肿瘤药物筛选模型奠定了基础。
- 朱京童张駪郑海洲郑智慧路新华董爱华段宝玲
- 关键词：肿瘤纯化
- 霉酚酸对人结肠癌SW620细胞凋亡的诱导作用及其机制被引量：2
- 2013年
- 研究霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)对人结肠癌细胞株SW620凋亡诱导作用及其机制.MPA处理SW620细胞后,MTT法测细胞增殖抑制活性,Hoechst 33258染色法检验细胞核形态变化.提取DNA并电泳检验DNA断裂情况,流式细胞仪检测凋亡和细胞周期的影响,并检验MPA处理后细胞中Caspase-3活性.Caspase-3抑制剂z-DEVD-FMK及MPA共同作用SW620细胞,检验DNA断裂的逆转情况.结果表明:MPA有效抑制SW620细胞的增殖,IC50为0.11mol/L.在浓度高于1.0mol/L时,经过MPA处理后的细胞核呈现明显的固缩现象,基因组DNA断裂为DNA ladder.流式细胞仪的测定结果说明MPA使细胞生长周期停滞于G1/S期,并能够浓度、时间依赖诱导SW620细胞出现典型的Sub-G1凋亡峰.进一步的细胞Caspase-3活性分析结果证明MPA能剂量依赖地诱导细胞中Caspase-3的活性,Caspase-3抑制剂z-DEVD-FMK能够部分地逆转MPA诱导的凋亡,说明Caspase-3在凋亡过程中起到了非常重要的作用.因此,MPA能够部分通过激活细胞中Caspase-3途径有效诱导结肠癌细胞SW620的凋亡,这可能是MPA抑制细胞增殖的一个重要分子机制.
- 栗若兰郑智慧路新华张雪霞董爱华段宝玲赵宝华
- 关键词：霉酚酸SW620细胞凋亡
- 糖皮质激素受体α调节剂高通量筛选模型的建立及应用
- 2014年
- 目的建立不同分子作用机制的糖皮质激素受体α（GRα）调节剂高通量筛选模型，筛选新型糖皮质激素受体调节剂。方法克隆 GRα的配体结合域 LBD 和全长基因，构建哺乳动物细胞表达载体 pBIND-GAL4-GRα LBD、pTARGET-GRα，分别与已构建的含 GAL4响应元件5× UAS 的荧光素酶报告质粒 p5× UAS-luc 和含有4× GRE 的报告质粒pGRE-luc 共转染 HeLa 细胞，建立两种不同机制的报告基因细胞筛选方法，通过报告基因的表达检测化合物对 GRα受体转录调控功能的调节剂作用；利用实时定量 PCR 方法进一步验证化合物对糖皮质激素受体靶基因 mRNA 水平的调控作用。 结果经过分别共转染表达质粒和报告质粒，GRα激动剂地塞米松可剂量依赖地诱导5× UAS-luc 和4× GRE-luc两个模型的荧光素酶的表达，在5× UAS-luc 模型中，最大上调倍数可达（9.0±0.2）倍，EC50值为（0.28±0.07）mmol/L， Z＇因子为0.52。在4× GRE-luc 模型中，最大上调倍数可达（3.2±0.3）倍，EC50值为（1.81±0.13）mmol/L，Z＇因子为0.49。利用模型 pBIND-GAL4-GRαLBD/p5× UAS-luc从2000多个微生物和植物来源的天然以及合成化合物中筛选得到1个微生物来源的天然产物黑麦酮酸 D，黑麦酮酸 D 对 GRα具有2-3倍的激动活性。进一步的定量PCR 的结果说明黑麦酮酸 D 能有效上调多个 GRα调控的靶基因的表达。 结论两种报告基因筛选方法灵敏、稳定，可以用于 GRα调节剂的高通量筛选。
- 孙彩霞张振亮郑海洲路新华郑智慧赵宝华段宝玲
- 关键词：糖皮质激素受体Α生物应答调节剂降血糖药高通量筛选
- 染料木黄酮的抗巨噬细胞泡沫化效应及其分子机制研究被引量：1
- 2013年
- 目的研究染料木黄酮对动脉粥样硬化过程中巨噬细胞泡沫化的抑制作用，并探讨其抗泡沫化的分子作用机制。方法采用体外OX．LDL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264．7产生泡沫化，通过油红0染色观察细胞内脂质聚集程度判定细胞的泡沫化程度以及药物效应；利用报告基因细胞检测方法评价染料木黄酮对代谢性核受体过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR和肝x受体LXR的转录调控功能的激动作用；利用实时定量PCR检测染料木黄酮对巨噬细胞中OX．LDL摄取以及胆固醇逆转运相关基因的mRNA水平。结果OX—LDL处理的空白组小鼠RAW264．7单核巨噬细胞内聚积大量的脂质，而经过10gg／ml染料木黄酮处理后的RAW264．7细胞内脂滴量明显减少，细胞泡沫化程度被大幅度降低。瞬时转染的细胞报告基因的转录激活效应研究结果说明，染料木黄酮对核受体PPAR和LXR均有较高的转录激活效应，其EC50值分别为3．5～9．2gg／ml和1．6～3_3gg／ml。定量PCR研究结果显示，染料木黄酮可以有效地使巨噬细胞中的胆固醇逆转运基因LXRa、LXRl3、ABCAl、ABCGl、和SR-B1的表达上调，而作为主要摄取OX—LDL受体的CD36基因的表达无明显变化。结论染料木黄酮可以有效抑制动脉粥样硬化过程中巨噬细胞的泡沫化，而该作用机制可能是通过激活PPAR和LXR通路，上调胆固醇逆转运蛋白的ABCAl、ABCGl、LXRGt、LXR13、SR．131基因的表达，增强了巨噬细胞的胆固醇外排，从而防止动脉粥样硬化的发生和发展。
- 宋静岚刘晨赵颖孟雅娟路新华赵宝华郑智慧段宝玲
- 关键词：染料木黄酮动脉粥样硬化泡沫细胞胆固醇逆转运
