国家自然科学基金(30300414)
- 作品数：10 被引量：16H指数：3
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- 自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD的构建及进行喉癌Hep-2细胞株转染研究被引量：5
- 2005年
- 目的:构建含酵母菌自杀基因CD的质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,并利用该载体进行喉癌Hep2细胞株转染研究,体外实验观察前体药物5FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞株的杀伤作用。方法:通过RTPCR从酵母菌RNA内扩增出CD基因全长CDS序列,将其定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV中,重组体质粒经XhoI/HindⅢ双酶切鉴定,并对重组体中的CD基因片段进行序列分析,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD运用电穿孔法转入喉癌Hep2细胞中。经300～600mg/LG418正筛选14d和10mg/L前体药物5FC负筛选,获得稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞株,提取该细胞株细胞的总RNA,经RTPCR鉴定CD基因的表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察不同浓度5FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞及转染空白载体pcDNA3.1(-)CMV的对照组喉癌Hep2细胞的杀伤作用。结果:阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD经XhoI/HindⅢ双酶切后获得5353bp的片段及496bp的插入片段,DNA自动序列分析证明重组体质粒含完整的477bp长的CD基因CDS序列。RTPCR从转染细胞总RNA中扩出453bp的预期片段。当添加不同浓度的5FC时,表达CD基因的Hep2细胞不同程度地被杀死,而对照组的细胞几乎未受到影响,两组细胞的相对生存率差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建了质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,建立了稳定表达酵母菌CD基因的喉癌Hep2细胞株,表达CD基因的Hep2细胞可以被5FC杀死。
- 唐瑶云肖健云赵素萍冯永张红茹
- 关键词：自杀基因喉肿瘤
- VP_3基因对鼻咽癌特异性杀伤效应的实验研究
- 2007年
- 鼻咽癌是中国南方地区常见的恶性肿瘤之一，主要采取局部放射治疗。鼻咽癌放疗后5年生存率在40％～50％，因此寻找一种新型的治疗手段，能够有效杀死鼻咽癌细胞，以弥补放疗的不足，对鼻咽癌的临床一线治疗具有重要意义。Peon等发现，VP3基因编码的apoptin蛋白能够高效杀伤多种恶性肿瘤细胞及转化细胞，而对正常细胞及未转化细胞无损伤。
- 邱元正徐婧唐瑶云田勇泉肖献忠赵素萍
- 关键词：鼻咽癌细胞VP3基因杀伤效应局部放射治疗恶性肿瘤细胞转化细胞
- 融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌的体外实验研究(英文)被引量：1
- 2006年
- 目的研究融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌。方法PCR扩增、酶切、连接、转化等构建质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CDglyTK,XhoⅠ/HindⅢ酶切鉴定,测序分析CDglyTK基因序列。建立稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞株,RT-PCR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。MTT法观察5-FC、GCV、5-FC+GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因,RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段,West-ern-blotting检测到该基因表达的59kDa的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5-FC、GCV、5-FC+GCV干预下生长受到抑制,5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。
- 唐瑶云徐婧刘建平郑颂扬赵素萍张俊毅肖健云
- 关键词：CDGLYTK基因治疗喉癌
- 间充质干细胞基因治疗肿瘤新进展
- 2008年
- 骨髓间充质干细胞（MSC）是骨髓内除造血干细胞和多功能前祖细胞外另一种成体干细胞，具有很强的自我更新能力、多向分化潜能。该细胞具有明显的趋向肿瘤移动并与肿瘤组织楔合的生长特性。虽然骨髓间充质干细胞有向肿瘤干细胞转化的风险，但其作为一种克隆载体可以转导治疗基因在体内获得长期稳定表达，对肿瘤的靶向治疗有着广阔的前景。
- 吴平唐瑶云赵素萍
- 关键词：间质干细胞基因疗法
- VP_3对鼻咽癌细胞CNE-2细胞株的体外杀伤效应被引量：1
- 2006年
- 目的:体外实验观察VP3对鼻咽癌CNE-2细胞株的杀伤效应。方法:构建质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.VP3-His,KpnI/EcoRI酶切鉴定,测序分析VP3基因序列。脂质体法将pcDNA3.1(-)CMV.VP3-His和pcDNA3.1(-)-His分别瞬时转染鼻咽癌细胞CNE-2细胞株,Western印迹鉴定VP3基因的表达。四甲基偶氮唑盐(methylthiazoletetrazolium,MTT)法检测VP3对鼻咽癌细胞株CNE-2的杀伤效应。结果:酶切和测序分析证实重组质粒中包含完整的VP3基因的编码序列,Western印迹在转染细胞总蛋白中检测到该基因表达的16.03kD的蛋白。表达VP3基因的CNE-2细胞生长受到抑制,而不表达VP3基因的CNE-2细胞生长未受到抑制。结论:VP3可杀伤鼻咽癌细胞CNE-2细胞株。
- 徐婧邱元正唐瑶云田勇泉肖献忠赵素萍
- 关键词：VP3杀伤鼻咽癌
- CDglyTK融合自杀基因杀伤喉癌Hep-2细胞的体外实验研究
- 2007年
- 目的:研究融合自杀基因CDglyTK联合前体药物对喉癌Hep-2细胞的杀伤效应。方法:构建质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CDglyTK,XhoⅠ/HindⅢ酶切鉴定,测序分析CDglyTK基因序列。电穿孔法将重组质粒转染Hep-2细胞,400mg/LG418筛选14d获得稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞,RT-PCR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。以转染空白载体pcDNA3.1(-)的Hep-2细胞为对照,MTT法观察5-FC、GCV、5-FC加GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果:酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因,RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段,Western-blotting检测到该基因表达的分子量为59000的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5-FC、GCV、5-FC加GCV干预下生长受到抑制,5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论:CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。
- 唐瑶云谢常宁刘建平赵素萍田勇泉肖健云
- 关键词：喉肿瘤
- 缺氧/辐射双敏感性启动子调控CD/UPRT融合自杀基因在Hep-2细胞表达的实验研究被引量：1
- 2006年
- 目的本研究拟构建缺氧/辐射双敏感性启动子,观察其在缺氧或放射诱导下调控CD/UPRT基因在喉癌Hep-2细胞的表达水平,为探索新的喉癌基因-放射治疗奠定实验基础。方法利用基因重组技术构建嵌合启动子HRE1.Egr-1调控CD/UPRT基因表达的质粒表达载体;脂质体介导重组质粒转染喉癌Hep-2细胞,分为对照组、放射组(2、4、6、8 Gy)、缺氧组(1%、2%3、%O2浓度)及放射加缺氧组(8 Gy+3%O2),Western-blotting法检测转染细胞中CD/UPRT表达。结果对照组细胞仅可检测到CD/UPRT的低水平表达,放射组蛋白表达的相对灰度值分别为1.3、1.6、1.8、2.9,缺氧组CD/UPRT基因表达相对灰度值分别为1.5、2.0、2.2,放射合并缺氧组CD/UPRT表达显著高于放射组或者缺氧组(P<0.01)。结论HRE1.Egr-1启动子具有辐射/缺氧双重敏感性,并使放射干预后的Hep-2细胞CD/UPRT表达水平在缺氧下得到显著增强,为喉癌的基因-放射治疗开辟了新思路。
- 唐瑶云邓小云徐婧张俊毅刘庭刘建平肖健云赵素萍
- 关键词：基因-放射治疗缺氧反应元件
- 胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶-磷酸核糖基转移酶融合基因/5-氟胞嘧啶治疗鼻咽癌的实验研究
- 2006年
- 目的研究胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖基转移酶融合基因／5-氟胞嘧啶（fusion cytosine deaminaseuracil phosphoribosyl transferase gene／5-Flurocy-tosine，FCU／5-FC）对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应以及对鼻咽癌移植瘤生长的抑制作用。方法构建表达质粒载体pcDNA3．1（-）CMVe·Egr-1·FCU，BamH Ⅰ酶切鉴定重组质粒，分析FCU基因和融合启动子CMVe·Egr-1的序列。电穿孔法将重组质粒转染CNE-2细胞，300μg／ml-600μg／mlG418筛选14天获得稳定表达FCU基因的CNE-2细胞，RT—PCR鉴定FCU基因的表达。以转染空白载体pcDNA3．1（-）的CNE-2细胞为对照，MTT法观察5-FC对表达FCU基因的CNE-2细胞生长的抑制作用，考察FCU基因的细胞旁杀效应。5×10^6的CNE-2细胞接种裸鼠右腋下，建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，12天后将裸鼠随机分成3组：CU组，CU＋PBS组和CU＋5-FC组，观察不同处理对移植瘤生长的抑制作用。结果酶切和序列分析证明重组质粒含完整的FCU基因和Egr-1启动子的核心序列，RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出330bp的预期片段。表达FCU基因的CNE-2细胞在5-FC干预下，生长受到抑制。随着表达FCU基因的细胞比例增加，细胞存活率相应地下降。CU组，CU＋PBS组移植瘤体积与CU＋5-FC组有显著性差异（P〈0．05）。结论表达FCU基因的CNE-2细胞可以被5-FC杀伤，FCU／5-FC系统抑制了移植瘤生长，为治疗鼻咽癌提供了新的策略。
- 唐瑶云钟宇赵素萍肖健云
- 关键词：胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶糖基转移酶基因疗法
- 质粒载体介导CD基因对喉癌细胞的杀伤作用研究(英文)被引量：3
- 2005年
- 目的构建含酵母菌自杀基因CD的质粒表达载体pcDNA3.1()CMV.CD,并利用该载体进行喉癌Hep2细胞株转染研究,体外实验观察前体药物5FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞株的杀伤作用。方法通过RTPCR从酵母菌RNA内扩增出CD基因全长CDS序列,将其定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1()CMV中,重组体质粒经XhoI/HindⅢ双酶切鉴定,并对重组体中的CD基因片段进行序列分析,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1()CMV.CD运用电穿孔法转入喉癌Hep2细胞中。经300～600μg/mlG418正筛选14d和10μg/ml前体药物5FC负筛选,获得稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞株,提取该细胞株细胞的总RNA,经RTPCR鉴定CD基因的表达。MTT法观察不同浓度5FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞及转染空白载体pcDNA3.1()CMV的对照组喉癌Hep2细胞的杀伤作用。结果阳性重组质粒pcDNA3.1()CMV.CD经XhoI/HindⅢ双酶切后获得5353bp的片段及496bp的插入片段,DNA自动序列分析证明重组体质粒含完整的477bp长的CD基因CDS序列。RTPCR从转染细胞总RNA中扩出453bp的预期片段。当添加不同浓度的5FC时,表达CD基因的Hep2细胞不同程度地被杀死,而对照组的细胞几乎未受到影响,两组细胞的相对生存率具有显著差异性(P<0.05)。结论成功构建了质粒表达载体pcDNA3.1()CMV.CD,建立了稳定表达酵母菌CD基因的喉癌表达CD基因的Hep2细胞株,表达CD基因的Hep2细胞可以被5FC杀死。
- 唐瑶云肖健云赵素萍冯永胡瑾
- 关键词：自杀基因
- HRE1.Egr-1.yCDglyTK融合自杀基因前药系统对鼻咽癌放射增敏作用的体外实验被引量：6
- 2008年
- 目的:构建缺氧/辐射双敏感性启动子HRE1.Egr-1,观察其在缺氧或放射诱导下调控yCDglyTK基因在鼻咽癌HNE-1细胞表达及yCDglyTK/5-FC对鼻咽癌HNE-1细胞杀伤效应,为探索新的鼻咽癌基因-放射治疗奠定实验基础。方法:利用基因重组技术构建嵌合启动子HRE1.Egr-1调控yCDg-lyTK基因表达的质粒载体;脂质体介导重组质粒转染鼻咽癌HNE-1细胞,建立稳定表达yCDglyTK基因的鼻咽癌HNE-1转染细胞;免疫印迹法检测在常氧、放射、乏氧、乏氧加放射等不同条件下HNE1细胞中yCDglyTK表达的强度;MTT法检测加入5-FC后对上述不同条件下稳定转染细胞的杀伤效应。结果:各组蛋白表达均有差别(P<0.01),以乏氧/放射处理最为明显;5-FC对各种条件干预下的细胞均有杀伤效应,其中以乏氧/放射处理最为明显(P<0.01)。结论:HRE1.Egr-1嵌合启动子具有放射和乏氧诱导的双重特性,可以显著增强yCDglyTK/5-FC系统在乏氧和放射干预下对鼻咽癌HNE-1细胞的杀伤效应,为鼻咽癌的基因-放射治疗开辟了新思路。
- 钟宇唐瑶云谢常宁赵素萍
- 关键词：鼻咽癌缺氧反应元件乏氧基因-放射治疗
