国家自然科学基金(30300328)
- 作品数：15 被引量：32H指数：3
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- IκBα突变型基因对缺氧缺糖损伤永生化神经前体细胞的保护作用
- 2008年
- 目的:检测在缺氧缺糖环境中,IκBα突变型基因对永生化神经前体细胞株(INPCs)NFκ-B的活性、细胞存活及细胞损伤的影响.方法:在建立转染pcDNA3.1及转染pcD-NA3.1/IκBαM INPCs的基础上,用MTT法检测缺氧缺糖处理3,6和9 h后两细胞株的存活率,用荧光素酶报告基因检测两细胞株缺氧缺糖6 h前后NFκ-B的活性,并测定缺氧缺糖6 h处理后培养液中乳酸脱氢酶的含量,用Hoechst33342染色观察细胞核的形态.结果:转染pcDNA3.1/κIBαM的INPCs中NFκ-B的活性均低于转染pcDNA3.1的INPCs,缺氧缺糖6 h或9 h时,前者存活率高于后者,且6 h时前者上清中的乳酸脱氢酶释放量较少,缺氧缺糖可使两细胞株的部分细胞核呈现凋亡改变.结论:κIBα突变型基因可降低INPCs中NFκ-B的活性,提高INPCs在缺氧缺糖处理后的存活率,减轻细胞损伤.
- 祝畅刘志恒张传汉桂伶俐姚文龙
- 关键词：干细胞细胞缺氧
- 人与鼠神经干细胞体外培养特性的比较被引量：2
- 2007年
- 目的:比较分析人及鼠神经干细胞体外培养的生长特性。方法:实验于2004-04/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验室完成。孕14d及新生Wistar大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,孕9周及孕16周水囊引产胎儿经胎儿家属同意捐赠,用1×1010L-1或1×108L-1的起始密度分离培养人和鼠神经干细胞。原代培养出现大量悬浮神经干细胞球后,一部分细胞继续悬浮培养,另一部分细胞种入用0.001%多聚鸟氨酸和0.2%明胶包被的培养瓶中贴壁培养。在培养9代左右的人神经干细胞及4代左右的鼠神经干细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷或5%胎牛血清继续培养1周。应用抗巢蛋白及抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷作为人及鼠神经干细胞初步鉴定,应用抗神经胶质酸性蛋白、微管相关蛋白2和2,3-环核苷酸磷酸二脂酶抗体检测其分化,SABC法进行免疫细胞化学染色。结果:①用较高(1×1010L-1)起始密度可有效的分离培养原代人神经干细胞,较低(1×108L-1)的起始密度对鼠神经干细胞分离有利,贴壁培养的人及鼠神经干细胞保持干细胞的特性长期增殖。②人神经干细胞自发聚集能力强、培养维持时间长,相比较而言,鼠神经干细胞单个细胞体积大、分裂增殖快、对起始密度依赖性小、贴壁能力强。③悬浮培养及贴壁培养的人和鼠神经干细胞,经抗巢蛋白及抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷免疫细胞化学染色,均显示阳性。血清诱导分化后,免疫细胞化学染色可显示出微管相关蛋白2、神经胶质酸性蛋白染色阳性的细胞,人与鼠神经干细胞分化后2,3-环核苷酸磷酸二脂酶的染色效果不佳。结论:人神经干细胞和鼠神经干细胞体外培养时生长特性有较大差异。表现为前者需要较高的起始培养密度、聚集能力强、培养维持时间长,后者单个细胞体积大、分裂增殖较快、贴壁能力强。
- 祝畅刘志恒桂伶俐高峰张传汉
- 关键词：神经科学干细胞细胞培养技术
- 不同胚龄人神经前体细胞分离培养及分化特性的比较
- 2007年
- 目的研究不同胚龄人神经前体细胞(neural progenitor cell,NPC)培养及增殖分化特性。方法取人胚原代细胞分为小胚龄全脑组、较大胚龄全脑组及较大胚龄纹状体组,悬浮培养。鉴定细胞球巢蛋白抗原的表达,分化及自我更新能力。观察各组培养细胞的生长、增殖状况。运用免疫荧光细胞化学法比较各组神经球分化后,神经元及星形胶质细胞的比例。结果各组培养出的悬浮细胞球巢蛋白抗原阳性,可分化为MAP2或GFAP阳性细胞,BrdU掺入实验阳性。培养1周时,较大胚龄纹状体组的神经球数目最多,形态最规则,其次分别为小胚龄全脑组、较大胚龄全脑组。采用有限稀释法可从较大胚龄纹状体组挑选单细胞克隆球。各组NPC诱导分化后,MAP2或GFAP阳性细胞率组间比较差异无显著性。结论不同胚龄人脑组织均可培养出NPC。取全脑时,随着胚龄的增加,NPC培养难度增大,但针对不同胚龄可采用不同的原代取材方法。不同胚龄NPC的星形胶质细胞及神经元分化比例一致。
- 桂伶俐张传汉刘志恒吴鹏
- 关键词：细胞培养神经前体细胞细胞分化
- 人NF-κB亚基p65、p50基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的建立和鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的构建分别携带人核因子-κB(NF-κB)亚基p65、p50基因的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株。方法以RcCMV-p65、RcCMV-p50质粒为模板,PCR扩增p65、p50基因编码区全长序列,分别克隆至逆转录病毒空载体pMSCVneo、pMSCVhyg,酶切、测序鉴定。将重组载体及空载体分别转染包装细胞系PT67,以G418或潮霉素筛选产毒细胞株。收集病毒悬液,测定病毒滴度,并瞬时感染NIH3T3细胞及人神经干细胞,72h后分别采用RT-PCR和免疫细胞化学观察p65、p50的表达。结果重组逆转录病毒载体pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50的酶切、测序鉴定正确。将筛选所得的高效产毒细胞株分别命名为PT67/pMSCVneo-p65、PT67/pMSCVneo、PT67/pMSCVhyg-p50及PT67/pMSCVhyg,测定病毒滴度分别为4×105、6×105、2×105及1×105cfu/ml。pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50病毒悬液瞬时感染NIH3T3细胞72h后,细胞p65、p50亚基mRNA的表达明显升高;瞬时感染人神经干细胞(hNSC)72h后,部分细胞胞核呈p65和p50阳性染色。结论成功构建了分别携带人p65、p50基因的逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、正确生产逆转录病毒的细胞株。为探讨转NF-κB基因神经干细胞在缺血性卒中的运用前景奠定了实验基础。
- 桂伶俐刘志恒张传汉祝畅高峰
- 关键词：干细胞移植核因子ΚB逆转录病毒科
- 人胚不同脑区神经前体细胞的分离培养及分化特性的比较被引量：1
- 2007年
- 目的研究人胚不同脑区神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)培养及增殖分化特性。方法取14-17周人胚脑区组织,分为新皮质、纹状体、间脑、中脑、后脑和延髓组,悬浮培养。鉴定细胞球巢蛋白抗原的表达,分化及自我更新能力。观察各脑区培养细胞的生长、增殖状况。新皮质、纹状体及间脑来源的神经球分化后,运用免疫荧光细胞化学法比较神经元及星形胶质细胞的比例。结果各脑区培养出的悬浮细胞球巢蛋白抗原阳性,可分化为MAP2或GFAP阳性细胞,且BrdU掺入实验阳性。体外培养第3d,纹状体及间脑组均可见大量神经球,且纹状体组明显多于间脑组;新皮质组传代后可见较多神经球;其它组仅见个别神经球。新皮质、纹状体、间脑来源的NPCs诱导分化后,MAP2或GFAP阳性细胞率各组间比较差异无显著性。结论人胚不同脑区均可培养出NPCs,从易到难依次为纹状体、间脑、新皮质及其它脑区。新皮质、纹状体、间脑来源的NPCs体外分化比例一致。
- 桂伶俐刘志恒张传汉祝畅高峰
- 关键词：细胞培养神经前体细胞细胞分化
- 局灶性脑缺血大鼠永生化神经前体细胞移植的可行性被引量：2
- 2006年
- 目的:观察局灶性脑缺血大鼠移植永生化神经前体细胞在脑内的存活情况,为进一步研究细胞移植及转基因治疗脑缺血提供有意义的数据及图像资料。方法:实验于2005-10/2006-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学实验室进行。①选取健康雄性SD大鼠18只,随机数字表法分为假手术组、脑缺血对照组、细胞移植组,6只/组。②脑缺血对照组、细胞移植组采用线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血模型。假手术组仅分离血管,不进行脑缺血处理。③应用无血清Neurobasal培养基进行INPC培养,移植前加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,标记3d,然后取出细胞爬片,无水甲醇固定10min,SP法检测BrdU标记细胞阳性率。④将BrdU标记3d的永生化神经前体细胞用胰蛋白酶消化,离心重悬后使细胞密度达到2×1010L-1,细胞移植组于大鼠脑缺血后3d取5μL永生化神经前体细胞移植到右侧纹状体缺血半暗带区,以前囟为零点,即A:-0.5mm,R:2.5mm,V:-4.5mm。脑缺血对照组仅注射等量磷酸盐缓冲液。⑤各组分别于缺血后6h,1d,3d及细胞移植后1周对大鼠进行Longa神经功能评价(0～4分,分数越高表示神经功能损伤越严重),缺血后6h神经功能评分≥1分视为模型成功。⑥细胞移植后1周处死各组大鼠,取脑组织制作冰冻切片,通过免疫组织化学SP法检测BrdU的表达,观察移植的永生化神经前体细胞在脑内缺血半暗带区的存活情况。结果:18只大鼠均进入结果分析。①体外检测移植细胞BrdU标记阳性率:永生化神经前体细胞加入BrdU标记3d后,免疫组化检测阳性细胞胞核呈棕黄色,细胞阳性率达95%以上。②造模后不同时间点各组大鼠神经功能评价:缺血后6h,脑缺血对照组与细胞移植组每只大鼠神经功能Longa评分均≥1分,表明造模成功,且Longa评分均明显高于假手术组[(1.70±0.48)分,(1.60±0.52)分,0分,P<0.05]。缺血后6h,1d,3d及细胞移植后1�
- 姚文龙张传汉钱巍祝畅桂伶俐刘志恒
- 关键词：干细胞脑缺血
- 人胚神经干细胞的长期贴壁培养和鉴定被引量：15
- 2006年
- 目的:探讨人胚神经干细胞的长期贴壁培养条件及传代方法。方法:在多种培养条件下,分别从9周和16周人胚脑中分离培养神经干细胞,应用免疫细胞化学的方法对所分离细胞的巢蛋白表达、自我更新能力和多向分化潜能进行鉴定。结果:采用高密度悬浮培养法能有效地从两种胚龄的人胚脑或室管膜下区中分离出神经干细胞,而采用贴壁培养法的人胚神经干细胞能保持干细胞的特性稳定增殖4个月。结论:从大小胚龄的人胚中均可成功分离培养人胚神经干细胞,贴壁培养的人胚神经干细胞能稳定增殖,是进一步进行人胚神经干细胞转基因研究的良好模型。
- 祝畅张传汉刘志恒桂伶俐高峰
- 关键词：人胚胎神经干细胞细胞培养
- GFAP特异性启动IκBα突变型基因真核表达载体的构建和鉴定被引量：1
- 2007年
- 目的构建GFAP特异性启动的、能稳定表达IκBα突变型基因的真核表达载体。方法用基因工程的方法将潮霉素抗性基因和GFAP特异性启动的IκBα突变型基因定向克隆入载体pBluescript-SK中,酶切反应鉴定重组载体SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM。用脂质体法分别将载体SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM转入永生化星形胶质细胞株和PC12细胞株中,经潮霉素(150μg/mL)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养,Westernblot检测阳性细胞株中IκBα的表达,以NF-κB特异性启动表达的荧光素酶报告基因检测细胞中NF-κB的活性。结果限制性酶切分析证实重组载体成功,稳定转染SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM的PC12细胞内IκBα蛋白质表达及细胞中NF-κB活性无差异,稳定转染SK-hyg-GFAP/IκBαM的永生化星形胶质细胞内有突变型IκBα的蛋白质表达,而转染SK-hyg的永生化星形胶质细胞内则没有,且前者细胞内NF-κB活性下降。结论GFAP特异性启动的、能稳定表达IκBα突变型基因的真核表达载体构建成功。
- 祝畅刘志恒张传汉姚文龙桂伶俐
- 关键词：启动子胶原纤维酸性蛋白IKBΑ
- 核因子-κB在神经干细胞中的作用被引量：8
- 2008年
- 核因子-κB(NF-κB)是一种功能多样的核转录因子,广泛存在于中枢神经系统。近年来研究表明,NF-κB也存在于神经干细胞(NSC)中,在NSC的增殖、迁移和分化等过程中发挥了重要的作用,现就该新兴研究领域的最新进展作一综述。
- 桂伶俐张传汉
- 关键词：核因子-ΚB神经干细胞增殖迁移分化
- IκBα突变型基因转染对永生化神经前体细胞生物学特性的影响
- 2007年
- 目的评价IκBα突变型基因转染对永生化神经前体细胞株（INPCs）增殖、分化及部分炎性细胞因子分泌的影响。方法在已经建立的转染pcDNA 3.1及转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs的基础上,用MTT法绘制两种细胞株的生长曲线,用流式细胞仪检测其增殖指数,以5%小牛血清诱导分化后,采用Western blot法测定两种细胞株的分化情况,同时用realtime RT-PCR测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA、白细胞介素-1β（IL-1β）mRNA和白细胞介素-6（IL-6）mRNA的表达。结果与转染pcDNA 3.1 INPCs比较,转染pcDNA 3.1/IκBαM INPCs的增殖指数、IL-1βmRNA和IL-6 mRNA表达降低（P〈0.05）,TNF-αmRNA表达差异无统计学意义（P〉0.05）。经血清诱导分化后,两种细胞株均大量表达胶原纤维酸性蛋白。结论IκBα突变型基因转染可减慢INPCs的增殖,并减少部分炎性细胞因子的表达,但对INPCs的分化无影响。
- 祝畅刘志恒张传汉桂伶俐姚文龙
- 关键词：转染细胞分化细胞因子类
