国家自然科学基金(30300294)
- 作品数：5 被引量：16H指数：2
- 相关作者：李立伟严杰邵浙新孙勇张勇更多>>
- 相关机构：浙江大学浙江大学医学院附属第一医院第三军医大学西南医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 肠三叶因子表达载体构建及在酵母菌GS115中的表达被引量：2
- 2007年
- 目的：构建肠三叶因子（ITF）的真核表达载体,并在酵母菌GS115中表达,为进一步研究ITF的生理和药理功能奠定基础.方法：通过RT-PCR获得ITF cDNA片断,将目的基因插入pPICZαA酵母表达载体,得到重组载体pPICZαA-ITF.经BspH I线性化后氯化锂转化进入GS115,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测表达蛋白.结果：经测序及PCR证实ITF cDNA准确插入酵母表达载体pPICZαA中.Tricine SDS-PAGE分析证明ITF的分子量约为14×10^3,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论：成功构建了真核表达载体pPICZαA-ITF,在酵母菌GS115中表达,获得重组ITF蛋白.
- 张勇孙勇吕尚军吴炜彭曦
- 关键词：酵母
- 肠三叶因子在大肠杆菌中的表达、纯化及其抗体制备被引量：1
- 2007年
- 目的:获得肠三叶因子(ITF)的原核表达产物及抗rITF抗体,为深入研究ITF的作用机制及其受体研究奠定基础。方法:常规提取人小肠组织总RNA,用RT-PCR获得ITF编码基因片段,克隆至质粒pET32a获得原核表达栽体,双酶切和测序后转化至Origami B(DE3)用IPTG诱导表达,优化条件获得最大表达产量;用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物,亲和层析纯化获得的重组蛋白rITF皮下多点注射家兔,制备多克隆抗体,并用此抗体进行大鼠肠组织免疫组化研究。结果:测序证实PCR扩增获得ITF全长基因序列与基因文库中的完全一致,将该基因片段正确插入表达载体pET32a中、优化表达条件后,重组蛋白的表达量达到50mg/L;Western blot证明重组蛋白具有良好的抗原性和特异性;通过Ni-NTA亲和层析、超滤离心后,得到90%纯度的蛋白;收集兔血清,纯化后获得特异性良好的ITF抗体,免疫组化染色肠组织显示ITF表达的部位定位于杯状细胞。结论:成功构建了表达载体pET32a-ITF,在大肠杆菌中表达并纯化获得纯度较高的rITF,并获得了生物活性较高的ITF抗体,ITF主要在肠道杯状细胞分泌表达。
- 张勇吴炜孙勇吕尚军彭曦
- 关键词：肠三叶因子大肠杆菌抗体制备
- 刚地弓形虫入侵细胞过程中细胞骨架和Ca^(2+)浓度变化被引量：5
- 2006年
- 目的探讨弓形虫入侵不同类型细胞过程中胞内游离Ca2+浓度及细胞骨架的变化。方法常规方法制备刚地弓形虫RH株速殖子悬液,分别感染吞噬性细胞(小鼠单核巨噬样细胞J774A.1)和非吞噬性细胞(人脐静脉内皮细胞HUVEC)。光学显微镜观察弓形虫感染情况及细胞骨架抑制剂秋水仙素、松胞菌素D对感染率的影响。用荧光显微镜观察弓形虫速殖子入侵J774A.1、HUVEC过程中细胞微丝和微管变化。用激光共聚焦显微镜检测弓形虫速殖子入侵过程中宿主细胞游离Ca2+浓度变化。结果正常J774A.1胞内游离Ca2+浓度为102.0%±6.2%。弓形虫感染后2min游离Ca2+浓度升高,测得荧光强度为305.2%±21.5%,感染后30～40min最高荧光强度为1219.7%±58.4%,显著高于基础值(P<0.01)。而经磷脂酶C抑制剂U73122预处理的J774A.1,Ca2+浓度无明显变化(P>0.05);虫体入侵过程中J774A.1微丝结构发生凝集。微丝结构抑制剂松胞菌素D(P<0.01)和微管结构抑制剂秋水仙素(P<0.05)均可明显降低弓形虫感染率。弓形虫入侵HUVEC过程中Ca2+浓度变化不明显(P>0.05),宿主细胞微丝、微管结构亦无明显变化。松胞菌素D和秋水仙素对弓形虫入侵HUVEC的能力影响均较小(P>0.05)。结论弓形虫入侵吞噬性细胞J774A.1过程中胞内游离Ca2+浓度显著升高,细胞骨架微丝结构发生凝聚,而入侵非吞噬性细胞HUVEC过程中胞内游离Ca2+浓度和细胞骨架均无明显变化。
- 李立伟邵浙新严杰
- 关键词：刚地弓形虫人脐静脉内皮细胞细胞骨架CA^2+
- 弓形虫侵入细胞过程中宿主胞内游离钙和胞外花生四烯酸的变化和来源
- 2008年
- 目的探讨刚地弓形虫侵入不同类型传代细胞过程中宿主胞内游离Ca^2＋和胞外花生四烯酸（AA）的变化和来源。方法采用核素液闪仪和激光共聚焦显微镜检测刚地弓形虫RH株侵入Veto和J774A.1细胞过程中宿主胞外AA和胞内游离Ca^2＋的变化及来源。对所获数据进行方差分析和t检验。结果弓形虫侵入J774A.1和Vero细胞后，宿主胞内游离Ca^2＋有不同程度升高，其最高荧光强度变化分别为（1219．7±58．4）％（t=4.982，P〈0.01）和（356.3±23．6）％（t=2.593，P〈0.05）。Vero细胞内Ca^2＋升高多来源于胞内Ca^2＋库释放，而J774A.1细胞内Ca^2＋升高来源于胞内Ca^2＋库释放和胞外Ca^2＋内流。弓形虫侵入Vero和J774A.1细胞后，宿主胞外AA均明显升高，分别为感染前的5.02倍和8.44倍（t=3.124，t=3.852，均P〈0.01）。磷脂酶怠抑制剂作用弓形虫后可明显抑制AA升高。结论弓形虫感染吞噬性细胞激活宿主胞膜磷脂酶C和弓形虫磷脂酶A2，引起宿主胞内游离Ca^2＋和胞外AA浓度升高，两者共同作用导致虫体侵入；虫体侵入非吞噬性细胞可能仅激活虫体磷脂酶A2。
- 李立伟严杰
- 关键词：弓形虫属J774A.1细胞花生四烯酸磷脂酶A
- 刚地弓形虫对HUVEC、Vero和J774A.1、THP-1侵入的比较研究*被引量：8
- 2006年
- 目的探讨刚地弓形虫对不同类型传代细胞的侵入能力和致凋亡作用及其差异。方法实验中采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero)、小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1)和人单核细胞系(THP-1)细胞株。采用透射电镜和吉姆萨染色法,观察刚地弓形虫RH株侵入以上细胞的能力以及细胞骨架抑制剂秋水仙素、细胞松弛素D对其影响。用流式细胞术检测弓形虫引起的细胞凋亡。结果弓形虫RH株能侵入以上4种细胞,在胞内均有纳虫泡形成。其侵入率以J774A.1和THP-1略高。细胞骨架抑制剂细胞松弛素D可以明显降低速殖子对THP-1和J774A.1细胞的侵入率,对速殖子侵入HUVEC和Vero细胞的能力影响较小。弓形虫侵入HUVEC和J774A.1细胞均可不同程度地引起细胞凋亡和坏死,但前者以凋亡为主,后者以坏死为主。结论弓形虫可能通过不同的机制侵入非吞噬性细胞和吞噬性细胞。
- 李立伟邵浙新严杰
- 关键词：刚地弓形虫HUVECTHP-1VERO
