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人端粒酶逆转录酶启动子调控下胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶融合基因治疗卵巢癌的体外研究被引量：18: 2004年; 目的　探讨人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子调控下的融合双自杀基因———胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶 / 5 氟胞嘧啶 +更昔洛韦 (CD TK/ 5 FC +GCV)系统对人卵巢癌细胞及正常细胞的体外杀伤作用。方法　应用脂质体转染法将hTERT核心启动子报告质粒pBTdel 2 79转染人卵巢癌细胞系3AO、正常卵巢上皮细胞 (NOEC)和人胚肺成纤维细胞株HELF ,用荧光素酶分析检测hTERT启动子活性 ;应用RT PCR技术检测hTERTmRNA的表达水平。应用基因克隆技术分别构建hTERT启动子和巨细胞病毒 (CMV)启动子调控下的CD TK基因真核表达载体pBTdel 2 79 CD TK和pcDNA3 CD TK ,以及hTERT启动子调控下的TK基因表达载体pBTdel 2 79 TK。用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法和流式细胞术检测pBTdel 2 79 CD TK/ 5 FC +GCV系统和pcDNA3 CD TK/ 5 FC +GCV系统对上述 3种细胞不同的杀伤作用 ;应用RT PCR技术检测pBTdel 2 79 CD TK和pcDNA3 CD TK转染前后 3AO和NOEC细胞中CD和TK基因的表达情况。用扫描电子显微镜观察pBTdel 2 79 CD TK/ 5 FC +GCV作用后 3AO细胞的形态变化。结果　卵巢癌细胞系 3AO中hTERT启动子活性增高 ,为 2 4 1% ,RT PCR检测hTERTmRNA为阳性 ,而在正常细胞NOEC和HELF中 ,hTERT启动子活性仅为 0 3%和 0 7% ,hTERTmRNA为阴性。; 孔北华宋悦马道新曲迅江森; 关键词：人端粒酶逆转录酶胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶基因治疗卵巢癌体外研究

人胚骨髓基质细胞饲养层对人胚胎生殖细胞生长的作用被引量：4: 2005年; 目的:研究人胚原代骨髓基质细胞(BMSC)饲养层对人胚胎生殖细胞(hEGC)生长的支持作用。方法:以非意愿妊娠流产胎儿股骨为材料制备BMSC饲养层;同时取胎儿组织分离培养人成纤维细胞,以成纤维细胞培养液上清制备条件培养液(CM)。另取13.5d胎鼠制备原代小鼠胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层。分组培养人原始生殖细胞:A组(PMEF饲养层)、B组(BMSC饲养层)、C组(CM)、D组(BMSC饲养层+CM),观察不同条件下hEGC生长增殖行为。结果:D组与A组均有利于支持人胚胎生殖细胞的体外生长,并保持其不分化的状态和多分化的潜能,两组比较无明显差异。单用B组可支持人胚胎生殖细胞的体外生长,但效率低于上述两组。单用条件培养液不能获得贴壁生殖细胞克隆。结论:BMSC饲养层+CM可支持hEGC的体外培养,且无异源性蛋白的污染,更有利于临床应用。; 姜景岩孔北华刘星霞侯怀水马秀峰沈柏均时庆; 关键词：胚胎生殖细胞原始生殖细胞骨髓基质细胞饲养层

人端粒酶逆转录酶启动子-二步转录增强系统调控下的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的构建及其对卵巢上皮性癌的治疗作用被引量：3: 2007年; 目的构建含人端粒酶逆转录酶启动子-二步转录增强系统(hTERTp-TSTA)调控下的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(rev-caspase-3)的重组腺病毒 AdHTVP2G5-rev-casp3,并检测其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)的治疗作用。方法采用基因重组法构建 AdHTVP2G5-rev-casp3,经 DNA 测序鉴定并证实其序列正确。实验分为4组:分别以 AdHTVP2G5-rev-casp3(AdHTVP2G5-rev-casp3组)、含 hTERTp 调控下的 rev-caspase-3的重组腺病毒 AdHT-rev-casp3(AdHT-rev-casp3组)和含人巨细胞病毒启动子(CMVp)调控下的 rev-caspase-3的重组腺病毒 Ad-rev-casp3(Ad-rev-casp3组)转染人卵巢癌细胞系 AO 细胞及正常人脐静脉内皮细胞系 HUVEC 细胞,以含 hTERTp-TSTA 调控下的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组腺病毒 AdHTVP2G5-EGFP(AdHTVP2G5-EGFP 组)为阴性对照。采用蛋白印迹法(western blot)、细胞计数法(CCK-8)、流式细胞术分别检测各组 AO 和 HUVEC 细胞中 caspase-3的活性单位 p17蛋白及其底物聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶的裂解片段 p85蛋白的表达强度、细胞存活率、细胞凋亡率和细胞周期的变化;western blot 法检测各组裸鼠移植瘤及肝脏组织中 p17蛋白的表达强度,检测各组裸鼠生存率、肿瘤体积、体内肝酶水平及各器官组织的病理检查结果。结果 AO细胞中 p17蛋白表达强度,AdHTVP2G5-rev-casp3组明显高于 Ad-rev-casp3和 AdHT-rev-casp3组;而HUVEC 细胞中 AdHTVP2G5-rev-casp3组则明显低于 Ad-rev-casp3,与 AdHT-rev-casp3组相似。当病毒感染复数(MOI)为70时,AO 细胞的存活率和凋亡率,AdHTVP2G5-rev-casp3组(分别为17.8%和40.2%)与 AdHT-rev-casp3组(分别为75.2%和16.1%)比较,差异有统计学意义(P<0.01);而HUVEC 细胞的存活率和凋亡率,AdHTVP2G5-rev-casp3组(分别为97.7%和2.1%)与 AdHT-rev-casp3组(分别为98.5%和1.7%)比较,差异则无统计学意义(P>0.05)。荷瘤裸鼠肿瘤组织中 p17蛋白的表达强度,AdHTVP2G5-rev-casp3组最高,Ad-rev-casp3组次之,AdHT-rev-casp3�; 宋悦沈铿何春霞; 关键词：端粒末端转移酶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

半胱天冬酶3前酶增强胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶融合双自杀基因系统治疗人卵巢癌的体外研究被引量：6: 2005年; 目的探讨半胱天冬酶3前酶(procaspase3)能否增强胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶/5氟胞嘧啶+更昔洛韦(CDTK/5FC+GCV)系统对人卵巢癌细胞的体外杀伤作用。方法构建procaspase3的表达载体pcDNA3casp3和人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控下的CDTK融合双自杀基因表达载体pBTdel279CDTK。应用蛋白印迹法检测pcDNA3casp3和pcDNA3质粒转染后的3AO细胞(3AOpcDNA3casp3、3AOpcDNA3细胞)中procaspase3蛋白的表达情况;应用RTPCR技术检测pBTdel279CDTK和pBTdel279分别转染的3AOpcDNA3casp3和3AOpcDNA3细胞中CD和TK基因的表达情况;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪技术、蛋白印迹法和荧光底物分析法分别检测4种细胞在CDTK/5FC+GCV系统作用后的细胞存活率、细胞周期及半胱天冬酶3(caspase3)活性。结果3AOpcDNA3casp3细胞有明显的procaspase3蛋白表达,而3AOpcDNA3细胞则无表达。3AOpcDNA3casp3和3AOpcDNA3细胞在pBTdel279CDTK转染后均可检测到CD和TK基因,但在pBTdel279质粒转染后则CD和TK基因表达均为阴性。在5FC+GCV作用下,3AOpcDNA3casp3+pBTdel279CDTK细胞的存活率显著低于3AOpcDNA3+pBTdel279CDTK细胞。在5FC(2mmol/L)+GCV(10μg/ml)作用48h后,3AOpcDNA3casp3+pBTdel279CDTK细胞的凋亡率为37.98%,S期比例为49.67%,分别高于3AOpcDNA3+pBTdel279CDTK细胞的21.34%和35.76%,两者分别比较,差异有统计学意义(P<0.05)。在5FC(1mmol/L)+GCV(1μg/ml)作用48h后,3AOpcDNA3casp3+pBTdel279CDTK细胞中的caspase3活性值为189.7,高于3AOpcDNA3+pBTdel279CDTK细胞的44.9,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论procaspase3可显著增强CDTK/5FC+GCV系统对人卵巢癌细胞的杀伤作用。; 宋悦孔北华马道新曲迅江森; 关键词：半胱天冬酶3 双自杀基因体外研究 CD-TK 四甲基偶氮唑蓝流式细胞仪技术

人脐血来源树突状细胞体外扩增及诱导特异性抗宫颈癌免疫应答被引量：1: 2006年; 目的:研究脐血来源树突状细胞(DC)体外扩增及诱导特异性抗宫颈癌细胞的免疫效应。方法:自人脐血分离单核细胞诱导DC,制备宫颈癌细胞系CaSki冻融物作为抗原负载DC。ELISA法检测成熟DC上清中IL-12的含量,混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC体外刺激T细胞增殖的能力,MTT法检测抗原负载DC激活的CTL对宫颈癌细胞CaSki和HeLa的杀伤作用。结果:与未经抗原负载的DC相比,抗原负载的DC刺激同种异体T细胞增殖和IL-12分泌的能力均有提高(P<0·05),激活的CTL对CaSki细胞有特异性杀伤,而此CTL对HeLa细胞无特异性杀伤。结论:宫颈癌细胞CaSki冻融抗原负载DC激活的CTL可诱导出特异性杀伤宫颈癌细胞的免疫效应。; 王华丽孔北华张建华张彩; 关键词：树突状细胞宫颈肿瘤冻融抗原细胞毒性T淋巴细胞

雷公藤内酯醇诱导上皮性卵巢癌Caov-3凋亡的实验研究被引量：8: 2005年; 目的 :观察雷公藤内酯醇对上皮性卵巢癌体外生长特性的影响 ,并进一步探讨有关的信号转导机制。方法 :分别采用MTT法、流式细胞仪测定和克隆形成实验观察雷公藤内酯醇对上皮性卵巢癌Caov 3增殖、凋亡和侵袭能力的影响 ,以Westernblot方法检测相关的信号分子。结果 :雷公藤内酯醇显著地抑制了Caov 3的增殖和克隆形成能力 (P <0 .0 5 ) ,诱导其凋亡 ,caspase途径和ERK活化主要参与了诱导凋亡的过程。结论 :雷公藤内酯醇对上皮性卵巢癌Caov 3生长特性的影响 ,使其有望成为一种新的化疗药物应用于卵巢癌的治疗。; 李鹏孔北华刘秋燕郭振红张明徽江森; 关键词：雷公藤内酯醇上皮性卵巢癌凋亡

人胚胎干细胞的培养条件与鉴别的方法学研究被引量：5: 2003年; 目的 :研究人胚肺成纤维细胞 (humanEmbryonicLungFibroblast,HELF)饲养层对人胚胎干细胞 (HumanEmbryonicStemCells ,hES细胞 )生长的作用 ,摸索适宜的hES细胞培养与识别方法。方法 :以流产胎儿肺组织制备HELF饲养层 ,取生殖嵴或背肠系膜及其周围组织 ,获得由人原始生殖细胞 (humanPrimordialGermCells,hPGCs)转化成的hES细胞。比较其在不同条件下的增殖行为 ,并通过生物学特性鉴别该细胞系。结果 :HELF饲养层在LIF存在的条件下有利于支持hES细胞的体外生长 ;hES细胞碱性磷酸酶组织化学染色及端粒酶ELISA检测阳性 ;具有正常的核型 ;在体外发展为类胚体。结论 :HELF饲养层和LIF的协同作用能支持hES细胞的生长 ;建立通过生物学特性鉴别hES细胞的方法。; 姜景岩孔北华曲迅马道新孙丽张友忠王波杨瑞芳王明毅; 关键词：人胚胎干细胞

活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3分子的构建及其致卵巢上皮性癌细胞凋亡的实验研究被引量：7: 2007年; 目的构建能自我激活的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3分子,并探讨其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞的致凋亡作用。方法利用基因重组技术构建活性 caspase-3分子——rev-caspase-3及其重组腺病毒——Ad-rev-casp3;应用免疫组化方法、细胞计数试剂盒8、流式细胞仪和蛋白印迹法分别检测 rev-caspase-3作用后卵巢癌细胞系 AO 细胞中活性 caspae-3蛋白的表达情况、细胞存活率、凋亡率、细胞周期、caspase-3活性亚单位 p17和聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)的分解产物 p85的表达水平,应用透射电镜观察 rev-caspase-3作用后细胞的超微结构,实时 PCR 技术检测细胞中凋亡相关基因的表达情况;建立卵巢癌裸鼠皮下及腹腔移植瘤模型,观测 rev-caspase-3作用后裸鼠生存情况及肿瘤体积的变化。结果 Ad-rev-casp3作用后的 AO 细胞中显著表达活性 caspase-3蛋白,细胞质明显棕染;细胞中活性 caspase-3亚单位 p17和 PARP 裂解片段 p85的表达水平升高。Ad-rev-casp3以感染复数(MOI)为70作用后的 AO 细胞存活率为30.3%,凋亡率为40.2%。Ad-rev-casp3以 MOI=10作用后的细胞凋亡率只为3.4%,但此时 S 期细胞比例高达56.5%,G_1期比例下降至9.8%,与未感染 Ad-rev-casp3(MOI=0)的 AO 细胞的 S 期和 G_1期比例显著不同(P 均<0.05)。Ad-rev-casp3作用后的 AO 细胞呈现显著的凋亡形态改变,电镜下见明显的凋亡小体形成;细胞中活性 caspase-3基因的表达水平显著升高,为9.44。Ad-rev-casp3能显著延长荷瘤裸鼠的生存期,平均生存时间为(213±16)d,并显著抑制移植瘤的生长,在第1次注射后53 d 时抑瘤率为70%。结论表达 rev-caspase-3的重组腺病毒载体对卵巢癌细胞有强烈的致凋亡作用,并可显著延长荷瘤裸鼠的生存期,抑制肿瘤生长。; 宋悦沈铿; 关键词：卵巢肿瘤半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶细胞凋亡

原代骨髓基质细胞联合细胞因子体外诱导ES-D_3细胞造血分化的研究被引量：1: 2006年; 目的：研究原代骨髓基质细胞联合细胞因子（VEGF，SCF和TPO）体外诱导ES-D3细胞造血分化的效率，探讨体外高效诱导胚胎干细胞生成造血干／祖细胞的方法。方法：取6～8周昆明鼠骨髓制备小鼠骨髓基质细胞（BMSC）饲养层。采用二步诱导法，先将ES-D3细胞诱导分化为拟胚体（EB），再将EB置于4种体系下诱导分化造血干／祖细胞；第1组：自发分化对照组；第2组：细胞因子组（VEGF加SCF加TPO）；第3组：BMSC饲养层组；第4组：BMSC饲养层加细胞因子组（BMSC加VEGF加SCF加TPO）。诱导分化1周的部分细胞行造血祖细胞集落培养。流式细胞仪检测诱导培养7d和14d的各组细胞中干细胞特异抗原（CD34）、祖细胞特异抗原（c-kit）、粒细胞表面抗原（CD11b）、红系细胞特异抗原（Ter119）阳性表达率。间接免疫荧光染色法显示CD34、c-kit、CD11b、Te〉119阳性细胞。RT-PCR检测造血转录因子GATA-2、FIk-1、SCL、p-H1和p-major珠蛋白的表达。结果：诱导7d生成的细胞均表达造血CD34和Pkit，诱导14d生成的细胞表达单核巨噬细胞、CD11b和Te〉119，且诱导细胞表达造血转录因子（GATA-2、SCL、β-H1、β-major）基因mRNA，培养在特定条件下可形成造血祖细胞集落。从生成造血细胞和造血集落的数量分析，骨髓基质细胞饲养层与细胞因子合用时诱导效率明显高于单用组和对照组（P〈0．05或0．01）。结论：骨髓基质细胞饲养层与细胞因子合用，体外可以促进ES-D3细胞的早期造血分化，产生的造血前体细胞可进一步形成造血集落并分化成熟，表达与造血转录和早期造血分化相关的基因。; 姜景岩孔北华李华沈柏均侯怀水时庆马秀峰; 关键词：胚胎拟胚体造血分化

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国家自然科学基金(30271361)

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