上海市自然科学基金(10ZR1423000)
- 作品数：5 被引量：19H指数：3
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- 相关机构：上海交通大学附属第六人民医院复旦大学更多>>
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- 重组IL-17A耻垢分枝杆菌的构建及其对巨噬细胞表达炎症因子的影响被引量：2
- 2012年
- 目的构建携带小鼠IL-17a编码基因的重组耻垢分枝杆菌(Recombinant Mycobacterium smegmatis,rMs),并研究其对巨噬细胞表达炎症因子的影响。方法双酶切质粒pET28a/mIL-17a和pMFA41,转化感受态E.coli TOP10,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMFA41/mIL-17a,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。分别以MOI为10∶1加入rMs、rMs+anti-IL-17A、Ms感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,并设PBS对照组。荧光定量PCR法检测转染细胞中β防御素-2(Defensinβ2,Defb-2)、巨噬细胞炎症蛋白(Macrophage inflammatory protein,MIP)-1α和MIP-2β基因mRNA水平;ELISA法检测细胞培养上清中MIP-1α、MIP-2β、IL-4及IFNγ蛋白的表达水平。结果重组表达质粒pMFA41/mIL-17a经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白mIL-17A可与大鼠抗小鼠IL-17A单克隆抗体特异性结合,在相对分子质量约20 000处可见特异性反应条带;rMs组RAW264.7细胞中Defb-2、MIP-1α、MIP-2β基因mRNA水平较Ms组及PBS组明显升高(P<0.01);rMs组细胞培养上清中MIP-1α、MIP-2β、IL-4和IFNγ的蛋白浓度较Ms组及PBS组明显升高(P<0.01)。结论成功构建了表达具有生物学活性mIL-17A的重组耻垢分枝杆菌疫苗,该疫苗可有效促进体外培养的巨噬细胞表达MIP、Defb2、IFN-γ及IL-4,为新型疫苗的研发奠定基础。
- 郭盛张建华吴良霞陈凌郝春莉范小勇
- 关键词：耻垢分枝杆菌白细胞介素17巨噬细胞炎症蛋白
- 重组小鼠白细胞介素-17F/His融合蛋白的原核表达、纯化及生物活性被引量：4
- 2010年
- 目的在大肠杆菌(E.coli)中表达并纯化重组小鼠白细胞介素-17F(rmIL-17F),并鉴定其生物活性。方法经RT-PCR扩增mIL-17f基因片段,定向插入原核表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17f,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化rmIL-17F/His融合蛋白,Western blot鉴定其反应原性。以纯化复性的rmIL-17F滴鼻干预小鼠,采用实时荧光定量PCR法检测小鼠肺组织IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测小鼠外周血IL-17F、IL-4和IFNγ的水平。结果扩增的mIL-17f基因DNA序列与GenBank中登录的mIL-17f基因序列一致,所构建的重组表达质粒pET28a/mIL-17f构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度约为95%,具有良好的反应原性,经黏膜给药后,可促进小鼠肺组织中IL-6 mRNA的表达,并提高小鼠血清中IL-4和IFNγ的水平。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达并纯化了具有生物学活性的rmIL-17F,为进一步研究IL-17F的功能奠定了基础。
- 陈凌郭盛郝春莉吴良霞张建华
- 关键词：白细胞介素-17原核细胞蛋白纯化生物活性
- 耻垢分枝杆菌黏膜接种对小鼠过敏性哮喘的免疫调节作用被引量：5
- 2011年
- 目的观察耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)对过敏性哮喘小鼠防御素β-2(Defb2)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)、IFN-γ、IL-4及过敏原特异性IgE、IgG1、IgG2a表达的影响,探讨Ms黏膜接种干预哮喘的免疫调节机制。方法 SPF级BALB/c小鼠随机分为哮喘组、干预组、对照组3组。以卵清蛋白(OVA)致敏,气道激发建立哮喘模型。OVA致敏前7 d鼻黏膜接种Ms进行干预。以Real-time荧光定量PCR法检测肺组织Defb2、MIP1、MIP2 mRNA的表达,ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)、纵膈淋巴结细胞培养上清中MIP1、MIP2、IFN-γ、IL-4的浓度,ELISA法检测血清总IgE以及OVA特异性IgE、IgG1、IgG2a水平。结果 Ms干预可以显著增高哮喘小鼠Defb-2 mRNA的表达(31.21±1.56对0.78±0.11,P<0.01);Ms干预可使哮喘小鼠表达增高的MIP1 mRNA降低(9.80±1.56对2.44±0.96,P<0.05),但对MIP2 mRNA的影响不明显(P>0.05);Ms干预可使BALF和淋巴结培养上清中MIP1、MIP2降低,使BALF和淋巴结培养上清中IL-4降低(97.43±7.83对153.80±5.20,150.75±54.58对625.81±55.98,P均<0.01),使BALF中IFN-γ升高(78.92±11.41对44.88±3.26,P<0.01);Ms干预可以显著降低哮喘小鼠血清总IgE、OVA-IgE、OVA-IgG1,升高OVA-IgG2a,降低哮喘小鼠OVA特异性IgG1/IgG2a比值(1.09±0.03对1.42±0.04,P<0.01)。结论 Ms黏膜免疫可以通过促进Defb-2表达增强哮喘小鼠抗感染能力,通过降低巨噬细胞炎症蛋白表达、调节Th1/Th2平衡、抑制过敏原特异性IgE表达等途径干预哮喘,耻垢分枝杆菌有望继卡介苗之后成为哮喘预防的另一候选疫苗。
- 郭盛吴良霞范小勇郝春莉马辉陈凌张建华
- 关键词：哮喘耻垢分枝杆菌巨噬细胞炎症蛋白防御素
- 重组白细胞介素-17A鼻黏膜免疫抗肺炎链球菌感染的实验研究被引量：6
- 2012年
- 目的观察小鼠重组白细胞介素-17A（rIL-17A）鼻腔黏膜免疫对感染肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae，sp）小鼠防御素6-2（Defb2）、巨噬细胞炎症蛋白（MIP）等表达的影响，探讨rIL-17A抗肺炎链球菌感染的机制。方法SPF级BALB／c小鼠随机分为3组：肺炎组、干预组、对照组，以鼻腔接种的方法建立肺炎模型，采用鼻黏膜免疫的方法进行rIL-17A干预。以real—time荧光定量PCR法检测肺组织Defb2、MIP—1α、MIP-2[3mRNA的表达，ELISA法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）、脾细胞以及纵膈淋巴结细胞培养上清中MIP—1α、MIP-2[3、IFN--γ、IL_4的浓度，并对BALF进行白细胞分类计数和却菌落计数，对肺组织进行病理分析。结果rIL-17A干预组BALF中Sp菌落数较肺炎组明显降低（2．18±0．94vs4．37±0．57，P〈0．01），中性粒细胞及巨噬细胞数量显著高于肺炎组（P〈O．01）；干预组肺组织Defb2、MIP—1αmRNA表达上调，其中Defb2mRNA表达量为对照组的53．93倍，与肺炎组比较差异有统计学意义（53．93±4．80VS14．49±5．84，P〈0．01）；rIL-17A干预组与肺炎组比较，淋巴结细胞培养上清中MIP—1α浓度增高明显（431．80±31．57VS291．10±5，62，P〈0．01）；MIP-2β浓度在脾细胞和淋巴结细胞培养上清中较肺炎组显著增高（246．20±11．50VS183．70±10．64，508．50±20．26vs290．90±15．20，P〈0．01），而肺泡灌洗液中浓度变化不显著（P〉0．05）；IFN-1浓度在BALF和细胞培养上清中均较肺炎组显著升高；IL-4除淋巴结细胞培养上清中外，BALF和脾细胞培养上清中均较肺炎组显著升高（92．42±3．82vs80．68±4．83，106．80±8．07VS73．57±7．43，P〈0．01）；干预组与肺炎组小鼠支气管及血管周围炎症细胞浸润无显著差异，但干预组组织损伤较轻。结论rIL-17A可通过促进Defb2以及MIP、IFN-1、IL-4等炎症因子的表达，增加炎症部位�
- 郭盛张建华吴良霞陈凌郝春莉范小勇
- 关键词：肺炎链球菌白细胞介素-17A巨噬细胞炎症蛋白趋化因子
- 重组白细胞介素17F对肺炎支原体感染小鼠体内防御素β-2及巨噬细胞炎性蛋白表达的影响被引量：2
- 2012年
- 目的观察重组白细胞介素17F(rIL-17F)对肺炎支原体(MP)感染小鼠体内防御素β-2(Defb-2)及巨噬细胞炎性蛋白(MIP)表达的影响,探讨rIL-17F防御MP感染的相关机制。方法 SPF级BALB/c小鼠随机分为感染组、干预组和对照组,以鼻腔接种的方式建立MP感染模型,以鼻腔黏膜免疫方式进行rIL-17F干预。采用荧光定量PCR法检测其肺组织Defb-2、MIP-1α、MIP-2βmRNA的表达水平,ELISA法检测其肺泡灌洗液(BALF)、脾脏及纵隔淋巴结细胞培养上清中MIP-1α、MIP-2β、IL-4、IFN-γ水平。结果 1.干预组MP菌落计数明显低于感染组,BALF中白细胞总数及中性粒细胞、巨噬细胞计数明显高于感染组,差异均有统计学意义。对照组无菌落生长。感染组BALF中白细胞总数及中性粒细胞、巨噬细胞计数明显高于对照组,差异均有统计学意义。2.干预组肺组织Defb-2、MIP-1α和MIP-2βmRNA表达水平均明显高于感染组,差异有统计学意义。3.干预组与感染组比较,MIP-1α水平在纵隔淋巴结细胞培养上清中明显升高,MIP-2β水平在BALF和纵隔淋巴结细胞培养上清中明显升高,差异均有统计学意义;IL-4水平在BALF中明显降低,在脾细胞培养上清中则明显升高,差异均有统计学意义;IFN-γ水平在脾细胞培养上清中明显升高,差异有统计学意义。感染组与对照组比较,MIP-1α水平在脾细胞及纵隔淋巴结细胞培养上清中均明显升高,差异有统计学意义;MIP-2β水平两组之间无显著差异;IL-4水平在BALF及脾细胞培养上清中均明显升高,差异有统计学意义;IFN-γ水平在BALF中明显升高,差异有统计学意义。结论 rIL-17F能促进Defb-2及MIP等炎性因子的表达,调节Th1/Th2平衡,增加感染部位中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞的聚集,提高MP清除率,增强机体抗感染能力。
- 陈凌张建华郭盛吴良霞
- 关键词：肺炎支原体巨噬细胞炎性蛋白
