国家自然科学基金(30571648)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
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- 丙型肝炎病毒core-Ant融合表达
- 2009年
- 目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)core对肝细胞的转分化作用,构建可以表达HCV core-Ant融合蛋白的原核表达载体.方法:已经构建的HCV core cDNA克隆质粒为模板,用PCR技术删除终止子,通过T载体克隆法构建pGEM-T-HCV core cDNA克隆质粒.经筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序后,通过常规分子生物学亚克隆方法,利用已有的pGEMT-Ant载体,连接Ant和HCV core cDNA在同一ORF,插入到pTE28表达载体,建立了表达HCV core和果蝇穿膜肽Ant的融合蛋白表达克隆.使用IPTG诱导方法,从表达菌中提取包涵体蛋白,复性后使用ELISA方法检测表达蛋白的抗原性.使用HRP标记的抗HCV核心抗体免疫组织化学一步法检测HCV core和HCV core-Ant融合蛋白对NIH 3T3细胞的转导能力.结果:pGEM-T-HCV core-Ant cDNA克隆的酶切物理图谱及测序证实结果证实建立了果蝇穿膜肽Ant cDNA克隆和删除了终止子的HCV core cDNA克隆.亚克隆后建立的重组质粒pTE28HCV coreAnt经限制性内切酶后,琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和设计预计值一致.序列测定结果表明HCV core cDNA和穿膜肽Ant cDNA处于同一ORF.通过转化BL21 DE3表达菌,IPTG诱导后,PAGE电泳成功表达了HCV core-Ant蛋白.复性后包被酶标板,间接ELISA方法检测抗HCV抗体阳性血清和正常人血清证实表达蛋白具有敏感和特异的抗原性.目标蛋白能转导进入NIH 3T3细胞显示了大量的阳性着色细胞.这些阳性着色细胞的着色颗粒主要存在细胞质中.表明构建表达HCV core-Ant融合蛋白的pET28原核表达载体成功.结论:通过分子克隆体外重组技术成功建立了表达HCV core-Ant的pTE28原核表达载体,为研究HCV core对细胞的转分化作用和HCV的致癌机制奠定了基础.
- 马列婷李砚王亚文
- 关键词：丙型肝炎病毒融合蛋白穿膜肽细胞分化
- 表达HCV core-Ant的重组慢病毒的构建被引量：1
- 2009年
- 目的构建表达HCV核心区的重组慢病毒,以探讨HCV感染后该病毒核心蛋白对肝脏干细胞转分化的影响。方法利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得HCV core-Ant基因克隆,酶切后连入pLenti6/V5-D-TOPO质粒,得到pLenti6/V5-D-HCV core-Ant,连同pLP/VSVG、pLP1和pLP2四质粒共转染293ET细胞,获得了表达HCV core-Ant重组慢病毒。收集病毒上清,大量扩增,用免疫组化法检测目的基因在Hela细胞的表达。用类似的方法构建了表达EGFP的重组慢病毒并测定其滴度。结果克隆出HCV core-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;使用表达HCV core-Ant重组慢病毒感染Hela细胞,免疫组化实验证实胞浆有HCV core表达。使用表达EGFP的重组慢病毒感染3T3细胞见到绿色荧光,说明构建慢病毒载体有效。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了表达HCV core的重组慢病毒,为进一步研究丙肝病毒致癌机制奠定了基础。
- 马列婷李砚王亚文
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白重组慢病毒分子克隆
