国家自然科学基金(30571672)
- 作品数：23 被引量：34H指数：3
- 相关作者：韩俊董小平韩露董辰方石琦更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心安徽理工大学西安交通大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技攻关计划国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 细胞浆中PrP蛋白的表达及其细胞毒性作用的研究被引量：1
- 2008年
- 为了探讨在胞浆中表达的PrP的理化特征以及对细胞活性的影响,我们构建了胞浆型PrP(CytoPrP)真核表达质粒,瞬时转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,通过蛋白酶敏感性实验检测CytoPrP及其蛋白酶抗性,利用MTT和Trypan Blue细胞计数检测CytoPrP的细胞毒性作用。结果显示,CytoPrP在胞浆内的存在受蛋白酶抑制剂的控制;与野生型PrP相比,CytoPrP具有相对较强的蛋白酶K(PK)抗性。MTT和细胞计数实验均显示,Cyto-PrP的存在可诱导明显的细胞毒性效应,而CytoPrP的细胞毒性作用受蛋白酶抑制剂含量的影响,呈剂量依赖关系。上述结果为研究CytoPrP在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的科学数据。
- 王新董辰方石琦石崧王桂荣雷艳君安润徐琨姜慧英韩俊赵玉军董小平
- 关键词：朊病毒细胞毒作用
- 一种基于连续PMCA的PrP^Sc体外扩增方法的建立被引量：1
- 2008年
- 为建立一种基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)的体外稳定扩增方法以观察PrPSc是否能在体外连续传代,我们分别制备了正常仓鼠和羊瘙痒病因子263K感染的发病仓鼠的全脑匀浆,将两种脑匀浆以不同体积比混合后,分别进行144个循环的直接PMCA和每轮48个循环、共8轮的连续PMCA,用Western blot对PrPSc的扩增情况进行检测。结果显示,与常规的直接PMCA方法相比,连续PMCA能更有效地使低浓度的PrPSc扩增到可检出的水平,表明连续PMCA可以支持羊瘙痒因子263K在体外长期稳定的复制。连续PMCA方法是一种体外高效地扩增PrPSc的方法,有潜力成为一种Prion体外培养方法,用于研究Prion错误折叠和复制机制,以及检测脑组织、外周组织和体液样品中的微量PrPSc。
- 石崧董辰方张宝云石琦王桂荣王新韩俊董小平
- 关键词：PRION病
- 重组人Doppel蛋白的表达及其细胞毒性作用的研究
- 2007年
- Doppel(Dpl)蛋白是新近发现的PrP相关蛋白。根据GenBank公布的人PRNDcDNA序列设计合成特异性引物,用PCR方法从人外周血白细胞总DNA中扩增获得531 bp的人PRND完整基因序列,测序正确后克隆至表达载体,转化大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达重组人Doppel(rhDpl)蛋白。目的蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的60%以上。表达产物用Ni2+亲和层析柱纯化及羟胺化学裂解法去除标签蛋白,SDS-PAGE检测证实,纯化的rhDpl蛋白相对分子量约为15 kD。Trypan Blue及MTT实验显示,在50μg/mL及以上剂量时,rhDpl蛋白具有抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞生长的作用,在100μg/mL及以上剂量时,rhDpl具有杀伤HeLa细胞的活性,呈现明显的剂量和时间依赖性。Hoechst33342荧光染色观察显示经rhDpl作用的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y呈现出细胞凋亡现象。这些结果提示Dpl蛋白具有体外细胞毒作用,并呈现明显的组织类型特异性。以上工作为进一步了解人Dpl蛋白体内外生物学作用奠定了基础。
- 李萍韩俊单冰雷艳君周伟姜慧英董小平
- 关键词：细胞毒作用
- 人tau蛋白外显子2和外显子3特异性抗体的制备
- 2009年
- 目的制备人微管相关蛋白tauN端的外显子2和外显子3特异性多克隆抗体。方法从人外周血DNA中获得tau蛋白外显子2及外显子3序列并连接至原核表达载体pGEX-2T，表达纯化重组融合蛋白GST—E2、GST-E3；以此融合蛋白免疫家兔及小鼠制备抗血清，通过ProteinG／A、偶联GST蛋白的溴化氰（CNBr）活化柱对抗血清进行亲和纯化；用WesternBlot及ELISA方法确定所制备抗体的特异性和敏感性。结果在大肠埃希菌中表达纯化出人tau外显子2和外显子3重组融合蛋白GST-E2和GST-E3，相对分子质量为29×10^3。免疫实验动物后获得抗血清，经系列纯化后WesternBlot和ELISA检测显示，制备的抗人tau蛋白外显子2和外显子3抗体具有良好的特异性和免疫反应效价。结论成功制备了4种人tau外显子2和外显子3特异性抗体，为进行tau蛋白在神经退行性疾病中的作用研究提供了基础。
- 陈操王桂荣石琦张宝云梅国勇李媛王新周瑞敏韩俊赵玉军董小平
- 关键词：蛋白质类外显子抗体病毒朊病毒病
- Tau融合蛋白及其缺失突变体与朊蛋白的体外作用分析被引量：1
- 2006年
- 在部分朊病毒病(priondiseases)中,高度磷酸化的微管相关蛋白tau与朊蛋白(prionprotein,PrP)发生共定位,tau蛋白可能在朊病毒病的病理机制中有重要作用.本室已经证明二者可以发生分子间相互作用,本文进一步分析了tau蛋白与prion的体外相互作用及作用位点.利用RTPCR方法从人源细胞系SHSY5YcDNA中扩增出微管相关蛋白tau全长cDNA序列,克隆至质粒pGEX2T载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白GSTtau.利用GSTpulldown及免疫共沉淀方法检测全长tau蛋白与PrP23231的分子间相互作用.进一步表达tau蛋白的各种缺失突变体,确定tau蛋白与PrP蛋白的相互作用位点.结果表明,所表达的全长tau蛋白及各种缺失突变体均为可溶性蛋白,Western印迹结果显示,各种蛋白均能很好的被tau蛋白单抗识别.GSTpulldown和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的全长tau蛋白可与全长的PrP蛋白在体外发生相互作用,并确定相互作用位点位于tau蛋白的N端序列及中段的重复区.上述结果为研究tau蛋白与PrP的相互作用在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的理论基础.
- 王小凡韩俊董辰方韩露万言珍李锋安润董小平
- 关键词：朊蛋白分子间相互作用
- 2006年1至8月份我国克雅病监测病例分析被引量：13
- 2007年
- 目的了解我国克雅病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD）的发病情况及分布特征。方法对2006年1至8月份我国克雅病监测网络获得的可疑CJD病例的l临床及流行病学资料进行分析；收集患者脑脊液及血液样品，利用Western Blot方法对脑脊液中14—3—3蛋白进行检测；利用PCR及测序方法对脚基因进行序列分析。结果共发现CJD临床诊断病例10例，疑似诊断病例8例。均为散发型CJD病例，病例的地理分布及职业没有明显的聚集性。发病年龄平均为60岁，男女比例接近1：1。首发症状中以快速进行性痴呆所占比例最多，占44％。临床诊断病例比疑似诊断病例出现更多的典型临床表现。结论我国监测到的CJD病例主要以散发型为主，地理、职业、男女比例以及平均年龄均符合散发型CJD的分布特点。
- 高晨韩俊周伟陈建明石琦张宝云向妮娟高永军董小平
- PrP八肽重复突变体对细胞生长影响的探讨
- 2007年
- 目的探讨PrP八肽重复突变体对细胞生长的影响。方法将具有遗传性朊病毒病相关不同八肽重复区插入突变的PRM，基因表达载体瞬时转染HeLa细胞，经噻唑蓝比色法（MTT）、Annexin—V／PI双染流式细胞检测。结果多八肽突变PrP蛋白对细胞的毒性作用较野生型明显增强。多八肽突变PrP较野生型更容易诱导凋亡发生，多八肽突变组早、晚期凋亡率均高于野生组。结论遗传性朊病毒病相关多八肽突变PrP蛋白可能较野生型更易诱导细胞凋亡发生。
- 韩露万言珍韩俊陈岚孙力王小凡黄银霞董辰方姜慧英董小平
- 关键词：朊病毒肽类噻唑蓝比色法细胞凋亡
- 鼠源抗haPrP23—231噬菌体抗体库的构建和初步鉴定
- 2007年
- 目的构建和鉴定鼠源抗haPrP23—231噬菌体抗体库。方法利用纯化的朊蛋白抗原免疫BALB／c小鼠，取脾，提取细胞总RNA，逆转录cDNA，以其为模板进行免疫球蛋白Fab区基因的特异性PCR扩增，将轻链和重链Fd段基因分别构建到pComb3质粒，构建噬菌体抗体库。结果经过四轮“吸附-洗脱-富集”的过程后获得了12株阳性克隆。挑取5株进行序列分析，并将结果与GenBank中已知序列库中的IgG序列进行比较，得到了两株不同的抗体，并进行了初步鉴定。结论本研究为朊病毒病的研究奠定了基础。
- 黄银霞韩俊董辰方孙力高晨王小凡韩露周伟张宝云姜慧英梁米芳董小平
- 关键词：朊病毒肽库细菌噬菌体
- PrP及其缺失突变体与GFAP体外相互作用的初步研究
- 2007年
- 目的研究PrP蛋白与GFAP蛋白是否发生分子间相互作用以及PrP蛋白多肽链中与GFAP蛋白相互作用的区域。方法制备仓鼠脑组织匀浆上清，通过原核表达系统以及体外翻译系统表达了全长的小鼠GFAP蛋白、人PrP蛋白以及各种缺失突变体，利用Pull-down及免疫共沉淀实验检测PrP与GFAP的分子间相互作用。结果不仅重组的GFAP与PrP发生分子间的相互作用，而且脑组织中的GFAP与prpc及Prp也发生相互作用。PrP与GFAP蛋白相互作用的区域位于PrP的C端第91至231位氨基酸。结论PrP及其缺失突变体与GFAP在体外能够发生分子间的相互作用，提示GFAP可能参与朊蛋白的正常生理功能或者朊病毒病的病理过程。
- 董辰方单冰王小凡韩俊董小平
- 关键词：朊病毒分子诊断技术
- 定位表达于溶酶体、泛素的PrP载体的构建及鉴定
- 2008年
- 目的构建定位于溶酶体、泛素的PrP表达载体，并进行蛋白表达特点及定位的鉴定。方法将泛素基因、溶酶体膜定位信号序列基因和PrP基因连接，克隆至pcDNA3．1载体中，构建表达载体pcDNA3．1-UPrP,pcDNA3．1-PrPL；瞬时转染真核表达细胞，经Western Blot和间接免疫荧光技术检测PrP表达特点。结果构建的各种PrP定位表达载体均可定位表达具有三种类型的糖基化分子的PrP，以双糖基化分子类型最多。带有泛素、溶酶体信号的质粒pcDNA3．1-UPrP、pcDNA3．1-PrPL的PrP表达随着时间的延长蛋白表达量下降，提示泛素、溶酶体信号能加速表达PrP在细胞内的降解。结论成功构建了溶酶体、泛素定位表达的PRNP核酸疫苗载体pcDNA3．1-uPrP、pcDNA3．1-PrPL，为PRNP核酸疫苗的研究奠定了一定的基础。
- 李媛梅国勇姜慧英王桂荣田婵陈操王新王克霞韩俊董小平
- 关键词：朊病毒疫苗DNA
