国家教育部博士点基金(20093234120004)
- 作品数：6 被引量：10H指数：2
- 相关作者：秦娣卢春朱小飞贾雪梅郝婷婷更多>>
- 相关机构：南京医科大学江苏省人民医院北京医科大学更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金江苏省高校自然科学研究项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组腺病毒表达载体介导艾滋病毒Vif蛋白调控KSHV潜伏感染的初探
- 2011年
- 目的:利用AdEasy腺病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型(艾滋病毒:HIV-1)病毒体感染性因子(Vif)的重组腺病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1细胞,并检测Vif蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi′ssarcomaassociated herpesvirus,KSHV)潜伏感染与裂解性复制的影响。方法:从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vif中扩增出Vif基因,插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中构建成pAdTrack-Vif,酶切线性化的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转化感受态BJ5183细胞构建成重组腺病毒质粒。重组腺病毒在AD293细胞中得到包装和扩增。用荧光计数法测定腺病毒滴度,以感染复数(MOI)为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并利用逆转录PCR(RT-PCR)和免疫印记(Western blot)技术分别检测Vif基因在靶细胞中的转录和表达情况,而且采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot分别检测KSHV裂解期基因ORF26 mRNA转录及裂解期蛋白vIL-6的表达。结果:经酶切鉴定、核酸序列测定、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功包装了携带HIV-1 Vif基因的重组腺病毒,滴度为2.5×108 TU/ml。重组腺病毒感染BCBL-1细胞48 h后,80%以上的细胞中表达GFP,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的基因Vif的条带。Real-time PCR和Western blot结果显示,Vif降低KSHV ORF26 mRNA转录水平及vIL-6蛋白表达。结论:成功包装了含HIV-1 Vif基因的重组腺病毒且在BCBL-1细胞中表达的HIV-1 Vif蛋白能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染。
- 贾雪梅王平秦娣卢春
- 关键词：KSHV病毒复制
- HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列的初寻被引量：2
- 2011年
- 目的:构建卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)ORF50启动子系列截短序列克隆,初步寻找HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列。方法:以KSHV基因组为模板,PCR扩增KSHVORF50启动子系列截短序列,克隆至含有虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的基本载体pGL-3中,构建含ORF50启动子系列截短序列的重组Luciferase报告质粒。系列重组报告质粒经酶切鉴定和序列测定分析后,分别转染单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染后的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),进行Luciferase活性检测,计算并比较相对Luciferase活性单位(Relative luciferase activity unit,RLU)。结果:成功分离、克隆KSHV ORF50启动子系列截短序列;HSV-1感染随后转染重组质粒p50-95、p50-46和p50-17与转染p50-1500、p50-750、p50-375及p50-185相比,Vero细胞中Luciferase活性显著下降。结论:成功构建了含KSHV ORF50启动子系列截短序列的重组Luciferase报告质粒;HSV-1所对应的、能够主导ORF50启动子活性的最小顺式调控区位于-185 bp和-95 bp之间。
- 程伟郝婷婷王子盾朱小飞冯宁翰华立新秦娣卢春
- 关键词：KSHVHSV-1虫荧光素酶
- 重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探被引量：3
- 2010年
- 目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）病毒蛋白R（Vpr）的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤（PEL）细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR（RT-PCR）检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数（MOI）为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹（Western blot）技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子（Rta）mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.
- 贾雪梅王平秦娣卢春
- 关键词：慢病毒卡波济肉瘤相关疱疹病毒
- 卡波氏肉瘤病毒K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探
- 2013年
- 目的:获得稳定表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)K1蛋白的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),探究K1蛋白对HUVECs增殖和迁移能力的影响。方法:从本实验室已构建好的含KSHV K1基因的重组真核表达质粒pCI-neo-K1中扩增出K1基因,克隆入慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green中构建重组质粒pHAGE-K1。利用脂质体将pHAGE-K1与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,收集培养上清经0.45μm滤膜过滤即获得慢病毒悬液。病毒感染HUVECs,Western blot检测K1蛋白的表达。通过绿色荧光蛋白进行流式分选、Western blot验证获得稳定表达K1蛋白的HUVECs。通过细胞增殖实验和细胞划痕实验检测K1蛋白对HUVECs增殖和迁移能力的影响。结果:核酸序列测定证实,克隆的K1基因全长906 bp,与GenBank中登记的K1基因100%同源。Western blot结果显示,含K1基因的重组慢病毒感染的HUVECs在约46 000处可观察到一特异性条带,与预期的K1蛋白大小一致。流式分选获得稳定表达K1蛋白的HUVECs,其增殖能力与对照组相比显著增强(P<0.01),细胞迁移能力亦明显增加(P<0.05)。结论:成功包装了含KSHV K1基因的重组慢病毒。KSHV K1蛋白能够促进HUVECs增殖和迁移。
- 程晓东薛敏郝婷婷秦娣卢春
- 关键词：增殖
- 重组慢病毒载体介导HIV-1 Nef蛋白对原发性渗出性淋巴瘤细胞系和血管内皮细胞增殖作用影响的初探被引量：1
- 2011年
- 目的:构建含有HIV-1负调控因子(Nef)基因的重组慢病毒表达载体,并检测Nef蛋白在人胚肾293T细胞、体腔渗出性淋巴瘤细胞BCBL-1和人血管内皮细胞EA.hy926中的表达情况及其对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。方法:从本实验室已构建好的含Nef基因的重组真核表达质粒pCI-neo-Nef中扩增出Nef基因,插入到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-Izs-Green中构建成pHAGE-Nef,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达并收集培养上清,此上清经0.45μm滤器过滤后即获得慢病毒悬液。梯度稀释法测定慢病毒滴度。将重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,用Western blot检测Nef蛋白的表达。通过细胞增殖实验检测Nef蛋白对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建了含HIV-1 Nef基因的重组慢病毒表达载体,病毒滴度为1×107 TU/ml。以重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,均能检测到Nef蛋白的表达,且Nef蛋白能够抑制BCBL-1和EA.hy926细胞的增殖作用。结论:成功构建了含HIV-1 Nef基因的慢病毒表达载体,获得的慢病毒不仅能够有效感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,而且能够介导Nef蛋白在这些细胞中表达。重组慢病毒载体介导的Nef蛋白能够抑制BCBL-1和EA.hy926细胞的增殖。
- 朱小飞秦娣周峰卫冰冰卢春
- 关键词：慢病毒NEF卡波济肉瘤
- 含KSHV vIL-6基因重组分泌型表达载体的构建及其分泌蛋白对内皮细胞增殖和血管生成能力影响的初探被引量：5
- 2011年
- 目的:构建含卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-assoliated herpesvirus,KSHV)致瘤基因vIL-6的重组分泌型质粒,将其导入内皮细胞系EA.hy926中进行表达,并检测vIL-6对内皮细胞增殖和血管生成作用的影响。方法:根据本实验室先前构建的pvIL-6 F表达载体中的核酸序列设计PCR引物,在其5′端及3′端分别引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位点,PCR扩增vIL-6基因,经双酶切纯化后将其克隆入分泌型真核表达载体pSecTag2B中。重组质粒经核酸测序鉴定后转染EA.hy926细胞,以Western blot检测vIL-6基因的表达情况;另外收集重组分泌型质粒转染293T细胞后的上清,通过细胞增殖实验和微管形成实验分别检测vIL-6通过自分泌或旁分泌方式对内皮细胞增殖和血管生成作用的影响。结果:限制性内切酶鉴定和基因测序证实成功构建了含KSHV vIL-6基因的重组分泌型质粒pSecTag2B-vIL-6,此质粒转染EA.hy926细胞后,Western blot能够在相应位置检测到目的蛋白vIL-6的条带。通过将pSecTag2B-vIL-6瞬时转染EA.hy926细胞或者收集pSecTag2B-vIL-6转染293T细胞后的上清作用于EA.hy926细胞,均观察到细胞增殖和血管生成能力的明显增强。结论:成功构建了重组分泌型质粒pSecTag2B-vIL-6;目的蛋白可在EA.hy926细胞中表达,且vIL-6能够通过自分泌和旁分泌方式促进内皮细胞的增殖和血管生成。
- 朱小飞秦娣卢春
- 关键词：KSHV分泌型细胞增殖血管生成
