国家自然科学基金(30571416)
- 作品数：9 被引量：48H指数：5
- 相关作者：雷连成韩文瑜韩俊友赵瑞利乔红伟更多>>
- 相关机构：吉林大学中国医学科学院北京协和医学院吉林省水产科学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 牛蛙(Rana catesbeiana)皮肤cDNA文库的构建与鉴定被引量：3
- 2008年
- 以牛蛙皮肤组织为材料获得总RNA,用偶联Oligo（dT）的磁珠纯化mRNA后,利用含SfiⅠ酶切位点的CDSⅢ引物在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1链,以含SfiⅠ酶切位点的CDSⅢ引物和SMART引物,利用LD-PCR合成双链cDNA,双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4DNA连接酶连接到经过相同酶切的λTripIEx2载体,体外包装后转染E.coliXLI-Blue宿主菌,进行滴度测试和文库扩增。结果构建的牛蛙皮肤cDNA文库原始库容量为1.42×10^6PFU/mL,插入片段长度在0.5～1.5kb,重组率为89.5%,扩增后的文库滴度为1.35×10^9PFU/mL,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的功能基因分析。
- 赵瑞利韩俊友李莲瑞乔红伟雷连成胡博谢芳刘丽凡韩文瑜
- 关键词：CDNA文库牛蛙抗菌肽
- 牛蛙皮肤抗菌肽Ranalexin基因的原核表达及其抑菌活性被引量：7
- 2009年
- 为了验证重组抗菌肽Ranalexin的抑菌活性,提取牛蛙皮肤组织总RNA,经RT-PCR扩增抗菌肽基因ranalexin,克隆测序后,将该基因插入pGEX-3X融合表达载体,进行原核表达,通过改变IPTG剂量、培养液pH值、诱导表达温度和诱导时间优化表达条件,并采用谷胱甘肽氧化/还原系统对重组蛋白进行复性,用琼脂扩散法测定其体外抑菌活性.结果显示,扩增获得的牛蛙皮肤抗菌肽基因ranalexin大小为201bp,其序列与GenBank公布序列同源性达99.57%;正确构建了pGEX-3X-Ranalexin表达载体,最佳表达条件为IPTG终浓度1.0mmol?L-1、诱导时间5～6h;表达产物的分子质量约为34kDa,并以包涵体的形式表达,经复性纯化后该重组蛋白对金黄色葡萄球菌具有明显的体外抑菌活性.说明牛蛙皮肤抗菌肽基因ranalexin的原核表达载体构建成功,并获得了具有抑菌活性的重组抗菌肽GST-Ranalexin.
- 谢芳韩文瑜雷连成韩俊友胡博
- 关键词：牛蛙抗菌肽原核表达
- 4种蛙皮肤活性肽的提取及生物活性比较被引量：4
- 2009年
- 利用80%甲醇和乙醚刺激方法,分别提取了4种两栖类动物皮肤粗提物和分泌物,并进行了生物学活性的测定。结果表明,4种蛙皮肤粗提物具有广谱抗菌活性,其中中国林蛙有轻微的溶血性,牛蛙与美国青蛙粗提物具有胰蛋白酶抑制剂活性;而4种蛙皮肤粗提物均无胰蛋白酶活性,牛蛙、美国青蛙与东北林蛙具有很强的凝集素活性。利用MTT法检测到4种蛙皮粗提物具有抗肿瘤细胞与抗病毒活性。
- 韩俊友赵瑞利韩文瑜雷连成冯新江丽娜乔红伟胡博
- 关键词：生物学活性MTT法
- 牛蛙(Rana catesbeiana)皮肤抗菌肽的cDNA克隆及序列分析被引量：3
- 2011年
- 为了解牛蛙皮肤抗菌肽的多样性及结构特点,根据GenBank数据库中蛙属抗菌肽基因信号肽序列设计简并引物,以RT-PCR技术扩增牛蛙皮肤抗菌肽基因,克隆得到cDNA全长序列并进行测序和序列分析。用生物信息学软件分析其cDNA序列特点,预测成熟肽的理化性质。结果得到48个完整的cDNA序列,分别编码24种抗菌肽前体,它们均由信号肽、前导肽和成熟肽3部分组成。对序列测定结果的预测分析表明,牛蛙皮肤抗菌肽前体核苷酸序列与已报道的其他蛙类抗菌肽具有较高的同源性,同源性达到80%以上,但成熟肽的序列变异很大,具有物种特异性,其中6个为新的抗菌肽序列。牛蛙皮肤抗菌肽成熟肽的二级结构主要以α-螺旋和β-折叠为主,均为疏水性短肽。
- 赵瑞利韩俊友韩文瑜雷连成江丽娜张俊敏欧阳萍
- 关键词：牛蛙抗菌肽CDNA克隆
- 牛蛙(Rana catesbeiana)蛙皮抗菌肽基因的克隆、测序及其表达被引量：12
- 2007年
- 利用RT-PCR的方法从牛蛙皮肤组织中克隆到大小为270bp的片段RCABP,将其克隆到pGEM-T载体,测序获得1个新的碱基序列。将此基因克隆到原核表达载体pQE-80L,获得融合表达质粒pQE-80L/DHFR/ABP,在1%IPTG诱导下进行表达。SDS-PAGE检测表明,重组蛙皮抗菌肽蛋白的表达量占菌体总蛋白的24%,以包涵体形式存在。体外抑菌试验表明,所构建的质粒能在大肠杆菌中表达具有体外抑菌活性的蛙皮抗菌肽,该融合蛋白具有良好的应用前景。
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- 关键词：牛蛙基因表达
- 牛蛙皮肤抗菌肽的cDNA克隆及序列分析
- 为研究牛蛙皮肤抗菌肽的多样性及其结构特点,根据GenBank数据库中蛙属抗菌肽基因信号肽序列设计简并引物,以RT-PCR技术扩增牛蛙皮肤抗菌肽基因,克隆得到cDNA全长序列并进行测序和序列分析。用生物信息学软件分析其cD...
- 赵瑞利韩文瑜雷连成韩俊友冯新江丽娜孙长江张俊敏欧阳萍
- 关键词：牛蛙抗菌肽CDNA克隆
- 文献传递
- 牛蛙两个新Temporins基因的克隆及其抗菌机制的研究(英文)被引量：7
- 2009年
- Temporins是从蛙属中得到的一类羧基端酰胺化的疏水性抗菌肽,具有抗细菌、霉菌、酵母菌、原虫及病毒活性.为了研究牛蛙皮肤抗菌肽的多样性及其结构特点,根据GenBank数据库中蛙属抗菌肽基因信号肽序列设计简并引物,从牛蛙皮肤cDNA文库中克隆到两个新的temporins家族抗菌肽,命名为temporin-La(LLRHVVKILEKYLamide)和temporin-Lb(LFRHVVKIFEKYLamide).合成的temporin-La和temporin-Lb肽具有很强的抗菌活性,尤其是对革兰氏阳性细菌.溶血性测定结果表明,temporin-La浓度高至250mg/L时对兔红细胞仍无溶血活性,而temporin-Lb具有较弱的溶血活性(半数致死浓度LC50≈230μmol/L).通过透射电镜观察temporin-La和temporin-Lb处理过的金黄色葡萄球菌的细胞结构,发现它们都能直接地杀死细菌,但作用机制不一样.
- 赵瑞利韩俊友韩文瑜雷连成孙长江冯新江丽娜乔红伟蔡林君
- 关键词：抗菌肽牛蛙透射电镜
- 大容量人源天然噬菌体抗体库的构建被引量：2
- 2008年
- 目的构建大容量(>108)的人源天然噬菌体抗体库。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,反转录出cDNA第一链,以此为模板,PCR扩增重链(VH)和轻链(VL)基因片段。将VL基因PCR产物插入含Loxp和Loxp511序列的pDF载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建轻链库,再将VH基因PCR产物插入轻链库载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建初级库。进一步用初级库超感染BS1365菌,使其VH与VL发生重组,获得重组库,再利用重组库感染大肠杆菌XL1-Blue,构建工作库。结果所有VH和VL亚类基因的扩增产物片段大小均与理论值相符,轻重链基因的克隆效率均为100%。初级库容量为108,滴度为6×1013;重组后的工作库有效容量为8×1010,滴度至少为1×1013。结论已构建容量为1010的人源天然噬菌体抗体库。
- 吴永强董关木秦思远杨晓明
- 关键词：抗体库FAB抗体
- 牛蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与活性测定被引量：9
- 2008年
- 目的分离纯化牛蛙皮肤抗菌肽,并检测其活性。方法通过刺激与浸提的方法,得到牛蛙皮肤抗菌肽粗提物,测定其抑菌活性及最低抑菌浓度。利用SephadexG-50凝胶过滤和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化粗提物,用质谱仪测定多肽的相对分子质量及氨基酸序列,并进行活性检测。结果两种方法提取的牛蛙皮肤抗菌肽粗提物均具有较强的抑菌活性,纯化后的多肽相对分子质量约为4370,N-端含22个氨基酸,与其他两栖类来源的抗菌肽同源性较低。活性试验表明均无胰蛋白酶水解活性,存在一定的胰蛋白酶抑制剂活性,有轻微的溶血活性,不具有局部出血活性,具有抗凝和溶栓作用。结论已成功分离并纯化了1种新的牛蛙皮肤抗菌肽。
- 赵瑞利韩文瑜韩俊友雷连成孙长江冯新乔红伟江丽娜刘延麟
- 关键词：牛蛙抗菌肽纯化活性
- Catesbeiania-1在毕赤酵母中的表达及其体外生物活性被引量：7
- 2010年
- 目的在毕赤酵母中表达抗菌肽Catesbeiania-1,并检测其体外生物活性。方法将从牛蛙皮肤上新分离的一条抗菌肽基因Catesbeiania-1克隆至真核表达载体pPICZaA,构建重组真核表达质粒pPICZaA-Catesbeiania-1。在毕赤酵母GS115中表达重组Catesbeiania-1蛋白,并进行体外生物活性测定。结果所构建的重组表达质粒pPICZaA-Catesbeiania-1序列完整,经Tricine-SDS-PAGE分析,表达的重组Catesbeiania-1蛋白相对分子质量约为5800,分泌性蛋白的表达量为36.3mg/ml。重组蛋白对几种常见的革兰阳性菌和阴性菌均具有较好的抑菌活性,无胰蛋白酶水解活性和抑制剂活性,具有很强的抗氧化能力。结论已成功表达了抗菌肽Catesbeiania-1,表达的重组蛋白具有一定的抑菌活性。
- 江丽娜韩文瑜雷连成赵瑞利欧阳萍
- 关键词：抗菌肽毕赤酵母真核表达生物活性抗氧化
