陕西省自然科学基金(SJ08C203)
- 作品数：5 被引量：9H指数：2
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- 复苏促进因子结合蛋白A的原核表达及对耻垢分枝杆菌的促生长作用被引量：2
- 2010年
- 目的:在大肠埃希氏菌中表达结核分枝杆菌复苏促进因子结合蛋白A(resuscitation-promoting factor-interacting protein A,RipA),观察该蛋白对耻垢分枝杆菌的促生长作用。方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv的DNA中扩增出编码RipA蛋白的Rv1477基因,测序正确后克隆入原核表达载体pProEx HTa,构建重组表达质粒pProEx HTa-RipA。以重组质粒转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性重组菌株,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside IPTG)诱导RipA表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的RipA蛋白加入到耻垢分枝杆菌中,分光光度法测定细菌的A600,观察RipA蛋白的促生长作用。结果:成功扩增了Rv1477基因,并克隆于表达载体pProEx HTa中,经酶切鉴定获得阳性克隆。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子量为52kDa的目的蛋白,Western-blot结果显示该蛋白与6×His单抗有特异性的反应条带。采用Ni+-NTA柱可获得纯化的目的蛋白。100pM的RipA蛋白可显著促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和生长。结论:RipA蛋白在大肠杆菌中成功表达,并能有效促进耻垢分枝杆菌的生长。
- 师长宏赵勇毛峰峰张海白冰江鹰
- 关键词：结核分枝杆菌休眠
- 结核杆菌潜伏感染小鼠模型的制备及其评价指标
- 2010年
- 目前对于结核分枝杆菌进入潜伏期的机制以及再激化的原因知之甚少,一个重要的原因是缺乏潜伏感染(LTBI)动物模型,完整的LTBI模型应包括两种类型,一是低剂量荷菌的持续性感染模型,另一种为潜伏感染模型,即Cornell模型的改进型。综合使用柯氏量表评分、脾肺荷菌数、诱导的IFN-γ和TNF-α水平、组织中IL-10和IL-4的表达、脏器中特异性抗原负荷以及激素诱导TB复发的时间、潜伏感染相关基因的表达水平等指标可以比较准确、客观、特异性的评价小鼠LTBI模型的反应性。
- 师长宏
- 重组结核分枝杆菌RpfE蛋白对BCG休眠菌的促生长作用被引量：4
- 2010年
- 目的观察重组结核分枝杆菌RpfE蛋白对BCG的促生长作用。方法将测序正确的Rv2450c基因克隆到表达载体pET32a(+)中,获得RpfE蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的蛋白分别与结核病人血清,Rpf单抗和Rpf结构域单抗进行Western blot分析。分别将10pmol/L和100pmol/L的RpfE加入到休眠BCG的培养基中,观察RpfE蛋白对BCG的促生长作用。结果得到融合组氨酸残基的重组RpfE蛋白,Western blot结果显示该蛋白分别与活动期结核病人血清,Rpf单抗和Rpf结构域单抗在40kDa处发生反应。100pmol/L的RpfE蛋白对BCG休眠菌具有明显的复苏和促生长作用。结论构建了MtbRv2450c基因的重组表达载体,纯化获得了RpfE重组蛋白,该蛋白对BCG休眠菌具有复苏和促生长作用。
- 郭晓雅师长宏史皆然张海赵勇邵成
- 关键词：结核分枝杆菌促生长作用
- 结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、Hsp16.3和ESAT6在血清学检测中的初步应用被引量：4
- 2011年
- 目的:探讨结核分枝杆菌分泌蛋白Hsp16.3、Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6用于TB病人血清学检测的意义。方法:将已构建的含5种目的基因的表达载体(pProEXHTb-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B、pProEXHTb-ESAT6-CFP10、pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6),分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6五种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。将经过复性的5种蛋白分别作为抗原,采用间接ELISA方法检测待测的血清样本,经OPD显色,测定各孔OD490值并判定结果。结果:五种蛋白被成功纯化并复性,通过ELISA方法共检测了22例TB病人血清、10例非结核病人血清和6例正常对照血清,Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6这5种抗原的灵敏度分别为36.4%、90.9%、77.3%、95.5%、100%,特异性分别为100%、75%、100%、93.8%、93.8%。统计分析显示,ESAT6-CFP10和Ag85B、Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6这三种蛋白ELISA检测的结果无差异,而与Hsp16.3和痰涂片检测结果有显著差异。结论:Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6可作为结核分枝杆菌ELISA检测的初选抗原。
- 张彩勤张海赵勇毛峰峰赵善民杨巍白冰师长宏
- 关键词：结核分枝杆菌AG85BHSP16.3ESAT6
- 结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和分泌蛋白Hsp16.3体外对人肝癌细胞HepG-2的作用
- 2011年
- 目的:探讨结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6及分泌蛋白Hsp16.3对人肝癌细胞HepG-2的作用。方法:将已构建的含3种目的基因的表达载体pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6和pProEXHTb-Hsp16.3,分别转入宿主菌E.coliDH5α中,诱导表达后分别获得Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和Hsp16.3三种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。复性的蛋白按照不同浓度和作用时间分别与肝癌细胞HepG-2反应,用MTT法检测细胞生长情况。结果:三种蛋白被成功纯化并复性。MTT数据统计分析显示,终浓度10μg/ml的三种蛋白对HepG-2细胞生长没有明显作用,当三种蛋白的终浓度分别为20、40、80μg/ml时均能够抑制HepG-2细胞的生长,并且抑制作用随着蛋白终浓度的增大以及作用时间的延长而增强。不同类别的蛋白抑制作用没有明显差别。结论:结核分枝杆菌的部分分泌蛋白能够抑制肝癌细胞HepG-2的生长。
- 杨巍师长宏张彩勤赵勇赵善民赵佐庆
- 关键词：结核分枝杆菌AG85BESAT6HSP16.3肝癌HEPG-2
