重庆市自然科学基金(2005BB5225)
- 作品数：5 被引量：9H指数：2
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP的构建及鉴定被引量：2
- 2007年
- 目的构建特异性强,转染率高,针对人Survivin进行RNA干扰的肿瘤增殖型腺病毒载体(Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP)。方法将针对人Survivin的shRNA的基因序列及EGFP基因序列克隆至肿瘤增殖型腺病毒穿梭质粒pAd-delE1b55kD;HEK-293细胞中包装出毒得到重组腺病毒Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP并测序鉴定。用重组腺病毒感染结肠癌细胞HT-29并检测转染率,用RT-PCR和Westernblot分别检测转染后的HT-29细胞中SurvivinmRNA和蛋白表达的变化。结果序列测定证明针对人Survivin的shRNA序列及EGFP序列被成功构建到肿瘤增殖型腺病毒载体中;Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP对结肠癌细胞HT-29的转染效率显著高于增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体(P<0.01);而对肝细胞的转染率则显著低于对结肠癌细胞株HT-29的转染(P<0.01)。与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较,转染Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP后,HT-29细胞中SurvivinmRNA拷贝数及蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论构建成功携带针对人Survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒载体Ad-delE1b55kD-shRNA/Sur-vivin-EGFP,其能选择性地高效转染结肠癌细胞株HT-29并有效干扰Survivin,且较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率。
- 王春毅傅仲学
- 关键词：RNA干扰存活素
- 肿瘤选择增殖型腺病毒载体研究进展
- 2006年
- 近年来,人们利用肿瘤细胞与正常细胞之间某些生物学性状的差异,构建了肿瘤选择增殖型腺病毒(CRAd)。其仅在肿瘤细胞中增殖,对正常细胞损伤小,以其为载体具有特别的优势。现就肿瘤CRAd的研究进展作一综述。
- 王春毅傅仲学
- 关键词：肿瘤基因
- 肿瘤增殖型腺病毒介导的shRNA干扰结肠癌细胞HT-29 Survivin基因的时效性研究被引量：2
- 2007年
- 目的探讨携带针对人Survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP介导的RNA干扰对结肠癌细胞HT-29中Survivin基因的时效性。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29(以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照),于转染后1d、7d、14d、28d分别检测其携带的外源性EGFP基因的表达及被转染HT-29细胞中Survivin mRNA和Survivin蛋白的表达。结果在转染后第7d,实验各组的外源性EGFP基因均有较高表达,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达被抑制,Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组的EGFP基因表达明显高于其他两种载体;在转染后第14d,后二者EGFP基因表达、Survivin mRNA及Survivin蛋白表达的抑制作用显著下降,而Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组的上述作用仍然很强;转染后28d,后二者EGFP基因表达、Survivin mRNA及Survivin蛋白表达的抑制作用基本消失,而Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组仍然保持很高的EGFP表达率和RNA干扰效率。结论Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP介导RNA干扰能长时间高效沉默结肠癌细胞HT-29中的Survivin基因。
- 王春毅傅仲学
- 关键词：RNA干扰SURVIVIN结肠癌
- 肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒pAd-delE1b55kD的构建被引量：3
- 2006年
- 目的:构建一种对肿瘤细胞有特异靶向性的高效载体-肿瘤特异增殖型腺病毒的穿梭质粒pAd-delE1b55kD。方法:利用二步法PCR等基因重组技术,将质粒pXC1编码E1B-55kD蛋白的基因区域缺失,并保留一个BglII酶切位点,以便插入外源性基因;利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性。结果:质粒pXC1的基因序列中,编码E1B-55kD蛋白的基因区中的2279～3326bp区域缺失,该区域上游的序列中第2024位碱基C点突变为T,第2252位碱基C点突变为T及第2261位碱基G点突变为T,从而在该区域上游插入了终止密码子TGA、TAG和TAA。在终止密码子下游,保留了一个BglII酶切位点。结论:成功构建了肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒载体pAd-delE1b55kD,为肿瘤的基因治疗提供了一种对肿瘤细胞有特异靶向性的高效载体的穿梭质粒。
- 王春毅傅仲学
- 关键词：肿瘤基因治疗穿梭质粒
- 靶向RNA干扰Survivin对结肠癌细胞HT-29增殖凋亡的影响被引量：3
- 2007年
- 目的探讨肿瘤增殖型腺病毒(Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP)介导的以人Survivin为靶标的RNA干扰对结肠癌细胞株HT-29中Survivin mRNA和蛋白表达及对HT-29增殖凋亡的影响。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29(以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照),用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和West- ern blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法、吖啶橙/溴乙锭荧光染色法、Annexin V-PE/7-AAD联合染色法检测细胞死亡率及凋亡率。结果与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较,转染Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP后,HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低,其细胞死亡率和凋亡率显著提高(P<0.05)。结论Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP介导的RNA干扰较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率,且能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。
- 王春毅傅仲学
- 关键词：腺病毒RNA干扰结肠癌脱噬作用
