广东省医学科学技术研究基金(A2009497)
- 作品数：13 被引量：22H指数：4
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- HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测
- 2009年
- 目的构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体。方法采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-HMGB1P。经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应。以转染空载体pDsRed1-1的细胞作为对照。结果PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRed1-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。转染空载体pDsRed1-1的细胞未见红色荧光。结论成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白B1红色荧光蛋白机械牵张
- 人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选
- 2010年
- 目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标记的人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni^2＋-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍（第4轮与第1轮回收量分别为5.2×10^8、7.0×10^6 pfu）,随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白质类细菌噬菌体肽库谷胱甘肽转移酶
- 利用生物素-链亲和素系统筛选呼吸机所致肺损伤HMGB1启动子结合蛋白
- 2009年
- 目的:筛选呼吸机所致肺损伤(VILI)高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的启动子结合蛋白.方法:制备VILI大鼠模型,与正常对照组大鼠同期处死,取肺组织提取细胞核蛋白.用PCR法扩增末端带生物素标记的HMGB1启动子探针,将细胞核蛋白与制备的HMGB1启动子探针进行孵育,再以标记有链亲和素的磁珠分离HMGB1启动子-蛋白反应复合物,分别用0.25mol/L和1mol/LNaCl洗脱探针上结合的蛋白,SDS-PAGE电泳分离样品蛋白,并对凝胶进行银染显色,比较VILI组与正常对照组的差异条带.结果:两组细胞核蛋白中共观察到24条差异条带.分析差异条带显示,与正常对照组比较,在低亲和力作用水平,机械通气后有6个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有2个蛋白的结合力减弱;在高亲和力作用水平,有10个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有6个蛋白的结合力减弱.结论:筛选到一些VILI特异性HMGB1启动子结合蛋白,对于研究HMGB1的转录调控机制具有重要意义.
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白B1急性肺损伤启动子
- MKK6p38α信号通路在机械牵张诱导肺泡上皮细胞表达晚期糖基化终末产物受体中的作用被引量：4
- 2009年
- 目的探讨p38α及其上游激酶丝裂素活化蛋白激酶6（MKK6）在机械牵张诱导肺泡上皮细胞（A549）表达晚期糖基化终末产物受体（RAGE）中的作用。方法应用阳离子脂质体DOTAP介导的基因转染方法将p38a显性无活性突变体p38α（AF）＋绿色荧光表达载体pGFP及MKK6b的组成性活性突变体MKK6b（E）＋pGFP分别导入A549细胞，以质粒pcDNA3＋pGFP作为阴性对照。以pGFP作为空白对照。应用蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）检测转染基因。建立体外细胞牵张应变模型，观察各组细胞在施加20％牵张应变时p38激酶活性变化及RAGE的蛋白和mRNA表达变化。结果Western blotting检测结果显示，外源基因成功转染A549细胞，并在细胞内表达。在A549细胞牵张应变模型中观察到，MKK6b（E）转染细胞内p38激酶活性明显升高，而p38a（AF）转染细胞内p38激酶活性显著下降；MKK6b（E）基因转染可促进20％牵张应变诱导A549细胞RAGE的蛋白和mRNA表达，而p38α（AF）基因转染则抑制牵引应变诱导的RAGE蛋白和mRNA表达。结论牵张应变通过MKK6p38α信号通路调节A549细胞RAGE的表达。
- 丁宁肖慧许立新余守章
- 关键词：机械牵张肺泡上皮细胞P38丝裂素活化蛋白激酶晚期糖基化终末产物受体
- 丙泊酚对呼吸机所致肺损伤大鼠的保护作用及其机制被引量：1
- 2012年
- 目的探讨p38信号通路在丙泊酚抑制呼吸机所致肺损伤(VILI)大鼠肺组织表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用。方法将32只健康SD大鼠随机分为4组,每组8只。对照组(A组)不行机械通气,保留自主呼吸;常规通气组(B组)潮气量(VT)为8ml/kg;大潮气量通气组(C组)VT为30ml/kg;大潮气量通气+丙泊酚组(D组)VT为30ml/kg,同时静脉注射丙泊酚8mg/(kg.h)。机械通气4h后处死动物,测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白水平、白细胞计数以及肺湿干重比值(W/D)和中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)活性。采用Western blot方法检测肺组织HMGB1蛋白含量以及p38的激酶活性,采用RT-PCR方法检测HMGB1 mRNA的表达。应用单因素方差分析进行不同组别间的比较。结果通气4h后,与A组相比,C组总蛋白水平(1.58±0.46)g/L、白细胞计数(112.05±21.33)×107/L、肺W/D比值(8.25±0.92)、MPO活性(3.08±0.85)U/g、HMGB1蛋白(0.43±0.13)和mRNA(0.30±0.08)表达以及p38激酶活性(0.52±0.11)均明显增加(P<0.05);与C组相比,D组上述各项指标的变化均明显降低(P<0.05)。结论丙泊酚可改善VILI肺内炎症反应,可能与通过p38信号通路抑制HMGB1蛋白和mRNA的表达有关。
- 程傲冰丁宁许立新佘守章
- 关键词：丙泊酚急性肺损伤高迁移率族蛋白B1P38丝裂原活化蛋白激酶
- 限制性输液对失血性休克大鼠血流动力学的影响被引量：2
- 2009年
- 目的探讨限制性输液对失血性休克大鼠血流动力学的影响。方法制作大鼠失血性休克模型,采取限制性输液和大量输液两种不同输液方法复苏大鼠失血性休克,对比各组不同时间点的血流动力学变化,记录出血量、输液量并计算生存率。结果休克模型120 min后,与大量输液组比较,限制性输液组的呼吸、心率降低,有统计学意义,平均动脉压和中心静脉压明显升高(P<0.05);休克急救期,限制性输液组失血量少于大量输液组(P<0.05),输液量明显低于大量输液组(P<0.05);休克后24 h和72 h生存率比较,限制性输液组高于大量输液组(P<0.05)。结论限制性输液能明显改善失血性休克大鼠的血流动力学,减少失血量以及输液量,提高生存率,是复苏失血性休克的理想方法。
- 肖慧丁宁刘灵芝佘守章
- 关键词：限制性输液血流动力学失血性休克
- 丙泊酚抑制机械牵张诱导的肺泡上皮细胞HMGB1启动子转录激活被引量：5
- 2009年
- 目的探讨丙泊酚对机械牵张诱导肺泡上皮细胞(A549)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1 pro-tein,HMGB1)启动子转录激活的影响。方法以基因重组技术将HMGB1启动子克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic,得到重组质粒pGL3-HMGB1P。采用脂质体介导的细胞转染技术将pGL3-HMGB1P和空载体pGL3-Basic分别转染A549细胞,以机械牵张和机械牵张+丙泊酚分别处理转染后的A549细胞,检测并比较荧光素酶活性,分别用Western blot和RT-PCR检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达。结果酶切和测序结果证实重组载体pGL3-HMGB1P构建正确,荧光素酶活性检测显示重组载体pGL3-HMGB1P在A549细胞中有效表达。与未牵张组比较,牵张组HMGB1启动子的转录活性和HMGB1表达均明显增加(P<0.05);与牵张组比较,牵张+丙泊酚组HMGB1启动子的转录活性和HMGB1表达均明显降低(P<0.05)。结论丙泊酚在转录水平通过抑制机械牵张诱导HMGB1启动子的转录激活而影响HMGB1的表达,可能是丙泊酚防治机械牵张引起炎症反应的机制之一。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：丙泊酚机械牵张肺泡上皮细胞转录活性启动子
- 应用噬菌体展示技术筛选HMGB1启动子结合蛋白被引量：5
- 2010年
- 目的:筛选高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子结合蛋白。方法:应用噬菌体展示技术,以HMGB1启动子DNA作为固相筛选分子,对噬菌体展示环七肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定。对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果:经过4轮筛选后,对随机选取的20个噬菌体克隆进行鉴定,其中11个可与HMGB1启动子结合。DNA测序后经过同源性搜索,确定了与HMGB1启动子具有结合作用的蛋白,包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等6种已知功能蛋白和2种未知功能蛋白。结论:筛选到HMGB1启动子的结合蛋白,为研究HMGB1基因的转录调控机制奠定基础。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白1启动子噬菌体展示肽库基因表达调控
- 应用LiquiChip液相蛋白芯片技术检测HMGB1诱导肺泡巨噬细胞的细胞因子表达谱被引量：1
- 2010年
- 目的检测高迁移率族蛋白B1(HMGB1)诱导肺泡巨噬细胞(AM)的细胞因子表达谱。方法 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA,插入pGEX4T-1原核表达载体并转大肠杆菌,IPTG诱导HMGB1表达,Ni2+-NTA和多粘菌素B亲和层析柱分离纯化。应用LiquiChip液相蛋白芯片检测HMGB1(20ng/ml)诱导AM细胞因子表达谱的变化。结果成功表达纯化的重组HMGB1可诱导AM肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、MIP-2、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及γ-干扰素(IFN)-γ的表达显著增加(P<0.01)。结论 HMGB1可诱导AM释放多种炎性细胞因子。
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白B1肺泡巨噬细胞细胞因子
- 机械牵张诱导THP-1细胞高迁移率族蛋白B1移位出核被引量：1
- 2011年
- 目的:探讨机械牵张对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在THP-1细胞内移位的影响。方法:构建HMGB1-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的真核表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合蛋白的形式克隆到pcDNA3-HA载体上,随后转染THP-1细胞并施加机械牵张应变,荧光显微镜观察HMGB1在细胞内的表达及移位情况。结果:重组质粒经酶切鉴定证明构建正确,并在THP-1细胞中大量表达。荧光显微镜观察发现,HMGB1-EGFP融合蛋白主要分布于细胞核,经机械牵张18 h,可见细胞中融合蛋白从细胞核移位到细胞质,在细胞浆中观察到明显的绿色荧光。结论:成功构建了HMGB1-EGFP融合蛋白,在THP-1细胞中观察到机械牵张可诱导HMGB1移位出核。
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：机械牵张高迁移率族蛋白质类THP-1细胞
