深圳市科技计划项目(200218)
- 作品数：10 被引量：60H指数：6
- 相关作者：刘志刚孙新李盟包莹喻海琼更多>>
- 相关机构：深圳大学蚌埠医学院深圳市微生物基因工程重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划深圳市科技计划项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 粉尘螨生殖系统形态学研究被引量：4
- 2008年
- 粉尘螨Dermatophagoides farinae是一种重要的医学螨类。本文用光镜和扫描电镜研究了粉尘螨雌雄生殖系统的形态和结构。结果表明:雄性生殖系统由睾丸、输精管、附腺、射精管、阳茎及附属交配器官组成。睾丸位于血腔末端,不成对,精原细胞、精母细胞和精子依照精子发育的顺序有规则地分布在其内部。雌性生殖系统包括交配孔、囊导管、储精囊、囊导管、卵巢、输卵管、子宫、产卵管及产卵孔,其中卵巢由一个中央营养细胞和围绕其周围的卵母细胞组成。
- 吴桂华刘志刚孙新
- 关键词：粉尘螨生殖系统形态学扫描电镜
- 尘螨连续石蜡切片的制备及染色技术被引量：5
- 2007年
- 研究尘螨连续石蜡切片的制备技术。利用琼脂预包埋后再以塑化石蜡包埋,经切片和HE染色,获得结构完整、定位准确、染色清晰的连续切片。探讨制片过程中一些步骤的改进和注意事项,为尘螨显微结构的形态学研究提供可能,也为免疫组化、原位PCR及过敏性疾病尘螨特异性变应原的定位等研究奠定良好的基础。
- 张莺莺刘志刚孙新包莹李盟
- 关键词：尘螨琼脂HE染色
- 屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定被引量：9
- 2006年
- 目的建立屋尘螨主要变应原Derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pET24a-Derp1质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Dot-ELISA方法分析Derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原Derp1蛋白。Dot-ELISA法检测结果表明经复性并纯化的Derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白Derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。
- 刘志刚杨慧付颖媛高波朱健琦吉坤美
- 关键词：屋尘螨变应原P复性纯化
- 重组屋尘螨2类变应原疫苗免疫治疗小鼠过敏性气道炎症的研究被引量：10
- 2006年
- 目的观察以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)材料为佐剂制备的重组屋尘螨2类变应原(rDerp2)纳米微粒疫苗(DEPN)对小鼠过敏性气道炎症的影响,并探讨其免疫治疗机制。方法制备PLGA-rDerp2纳米粒子并鉴定其特性。40只BALB/c小鼠随机分为5组,A组(对照组)均给予生理盐水(100μl)。B、C、D和E组腹部皮下注射屋尘螨粗浸液(10μg)免疫小鼠致敏,然后分别用PBS(100μl)、2mg空白PLGA粒子(emptyPLGA,EP)、100μgrDerp2、2mg的DEPN纳米疫苗(载有100μgrDerp2)皮下注射进行免疫治疗,连续免疫治疗3d,1次/d,各组用rDerp2(50μg)滴鼻激发,激发后第2天剖杀,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)并对细胞进行总计数和分类计数;HE染色和PAS染色(PeriodicAcid-SchiffStain)观察小鼠肺部组织炎症和支气管黏液分泌;用ELISA检测BALF和脾细胞培养上清的细胞因子(IL-4、IFN-γ)和血清中变应原特异性IgG2a和IgE抗体浓度。结果B、C组肺部呈明显的变态反应性炎症,D、E组变应原诱导的肺部嗜酸粒细胞浸润和黏液分泌比B、C组显著减轻。BALF中的细胞总数B组比A组明显增多,分类细胞以中性和嗜酸粒细胞为主,超过50%。rDerp2特异性IgE抗体水平,D组(0.93±0.04)和E组(0.77±0.10)均低于B组(1.14±0.10)(P<0.01);特异性IgG2a抗体水平,D组(1.02±0.01)和E组(1.17±0.46)均高于B组(0.14±0.01)(P<0.01)。在BALF中,D组[(55.60±3.79)pg/ml]和E组[(48.60±4.50)pg/ml]IL-4水平均低于B组[(78.90±6.07)pg/ml](P<0.01);IFN-γ水平E组[(68.50±2.87)pg/ml]显著高于B组[(27.30±3.51)pg/ml](P<0.01)。脾细胞上清的IL-4水平,D组[(56.3±4.85)pg/ml]和E组[(40.2±4.36)pg/ml]显著低于B组[(81.20±6.84)pg/ml](P<0.01);IFN-γ水平,E组[(70.20±3.85)pg/ml]显著高于B组[(34.60±2.25)pg/ml]。结论DEPN免疫治疗可抑制小鼠肺部过敏炎症,其机制可能与调节Th1/Th2平衡有关。
- 喻海琼刘志刚于琨瑛许卓谦丘劲
- 关键词：屋尘螨变应原过敏性气道炎症小鼠
- 热带无爪螨体内特异性变应原定位被引量：1
- 2009年
- 【目的】探讨热带无爪螨Blomia tropicalis特异性变应原在体内的定位。【方法】制作热带无爪螨石蜡切片,HE染色后光镜观察其内部形态结构。选用对尘螨过敏患者的阳性血清特异性IgE抗体作探针,免疫组织化学染色分析其特异性抗原存在位置。【结果与结论】免疫组织化学染色可见热带无爪螨中肠、盲囊、结肠的肠壁和内容物及生殖腺等均有阳性反应。其中肠壁组织和肠腔内容物呈强阳性反应,提示肠为特异性抗原的主要存在部位。
- 吴桂华刘志刚孙新杨峰巍
- 关键词：变应原抗原定位免疫组织化学HE染色
- 屋尘螨Ⅰ类变应原Der p1的体内定位被引量：11
- 2005年
- 对过敏性疾病主要过敏原屋尘螨Dermatophagoides pteronyssinusⅠ类变应原(Der p1)进行了抗原定位研究。选用经表达和纯化的Der p1抗原蛋白,按常规方法免疫小鼠,分离血清获抗重组Der p1的抗体(Ⅰ抗),用抗鼠IgG荧光抗体为Ⅱ抗,屋尘螨经石蜡切片,在荧光显微镜下对其特异性变应原的定位进行观察。HE染色显示屋尘螨消化系统占据大部分体腔。组织免疫荧光发现屋尘螨Ⅰ类变应原主要定位于螨的中肠组织及肠内容物,而螨的生殖系统、排泄系统等脏器以及几丁质甲壳均呈阴性反应。据此认为屋尘螨Ⅰ类变应原存在于螨的肠内容物和中肠组织中。
- 刘志刚李盟包莹付仁龙苏东明
- 关键词：屋尘螨P1抗原定位HE染色免疫染色
- 粉尘螨消化系统的形态学观察被引量：3
- 2007年
- 光镜下观察了粉尘螨Dermatophagoidesfarinae消化系统结构,其组成包括:口前腔、前肠、中肠、后肠、肛门和唾液腺。口前腔由颚体围绕而成;前肠包括一个肌肉的咽和食道,食道从脑中穿过;中肠分为前中肠(包括一对盲肠)和后中肠,中肠的上皮细胞呈现多种形态;后肠包括相对大的结肠和狭窄的直肠;消化腺为不规则形,位于脑前方。本文阐述了消化道的分支情况、显微结构及细胞形态。
- 张莺莺刘志刚孙新包莹李盟
- 关键词：粉尘螨形态学
- 表面等离子体共振技术检测重组户尘螨变应原rDer p2与抗体的结合被引量：8
- 2009年
- 利用表面等离子体共振技术对屋尘螨重组变应原(rDer p2)与单克隆抗体之间的结合作用进行了研究,并且运用该技术对尘螨过敏患者血清与变应原之间的结合作用进行了初步探讨。变应原和抗体之间的结合通常是通过免疫吸附技术或者酶免法来进行研究的,这些方法一般需要对分析物进行标记,由于背景的影响和低灵敏度,目前对抗原和抗体的反应检测所用的免疫吸附技术的准确性还远不如表面等离子共振技术。用氨基偶联法将重组变应原rDer p2固定在CM5传感片表面上后,表面等离子体共振(SPR)技术检测的结果显示,rDer p2与尘螨过敏患者血清的结合作用比单克隆抗体要弱得多。而且,尘螨过敏不同患者血清与rDer p2的结合有很大的差异性。本研究为临床上对过敏疾病的诊断提供了一个简单、快速和实时监控的检测手段。
- 刘志刚黄海珍袁萍
- 关键词：P2抗体
- PLGA为佐剂的OVA纳米疫苗皮下注射可预防小鼠过敏反应性气道炎症和调节Th1/Th2反应被引量：6
- 2007年
- 目的探讨聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(D,L-lactic-co-glycolic)acid,PLGA]包裹的卵清蛋白(OVA)纳米疫苗(POM)对哮喘小鼠的免疫治疗效果。方法包裹不同剂量(低、中、高)的OVA纳米粒子和对照(OVA、空白纳米粒子、PBS)通过皮下注射给予小鼠,再用OVA进行致敏和激发,通过肺组织学、支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数、测定BALF和脾细胞培养上清液中细胞因子的含量,观察小鼠呼吸道炎症和免疫学改变。结果肺部组织学和BALF中细胞计数结果显示,与PBS对照组相比,OVA治疗组、中剂量和高剂量OVA纳米组的肺部嗜酸性浸润显著减轻,BALF中总细胞和嗜酸性细胞显著减少。细胞因子测定结果显示,与PBS对照组相比,中、高剂量OVA纳米组的BALF和脾细胞培养上清液中IFN-γ显著升高,IL-4水平显著降低。OVA治疗组中IL-4水平显著下降,而IFN-γ水平无显著差异。结论OVA纳米疫苗可预防哮喘嗜酸性气道炎症,其可能的机制之一是调节了过敏性哮喘的Th1/Th2失平衡反应。
- 喻海琼刘志刚曾琼
- 关键词：OVA
- 粉尘螨Ⅱ类变应原的克隆表达、纯化及其免疫学特性被引量：6
- 2006年
- 目的获得大量具有良好的IgE结合活性的Der fⅡ重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增Der fⅡ片段,产物连接进入T载体(pMD18)。经扩增后,用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段连接到pET-24a表达载体上,得到重组质粒pET-Der f2,工程菌经IPTG诱导培养,明显表达出Der fⅡ蛋白,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用Western blot检测免疫学活性。结果成功提取粉尘螨的总RNA,扩增出编码129个氨基酸的长度为387个碱基对的核苷酸片段。序列分析结果和Genebank上的基因序列(D10448)同源性98%,其中有6个碱基不同。使用高效表达的原核载体pET,所得产物的5′端含有抗原性极小的6个组氨酸标签。表达质粒在E.coliBL21 star中得到高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,目的蛋白具有良好的变应原性。结论成功构建了粉尘螨Ⅱ类变应原的原核表达载体,并纯化了具有免疫特性的重组蛋白,为进一步开展Der fⅡ蛋白和重组疫苗研究奠定了基础。
- 朱健琦刘志刚高波吉坤美邢苗
- 关键词：粉尘螨变应原纯化
