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低温胁迫对裂殖壶菌DHA生物合成及SOD表达的影响被引量：15: 2010年; 培养温度对裂殖壶菌产油脂中二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)含量以及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)表达水平均有重大影响。细胞干重测定和气相质谱联用法检测了不同温度下裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512的生长和脂肪酸组成,荧光定量PCR法比较各温度下SOD mRNA表达量。结果表明,低温有利于DHA的合成,低温胁迫下SOD mRNA表达量最高。探讨裂殖壶菌耐低温胁迫的机制可能是低温增加培养基中溶解氧水平,氧化应激造成SOD的高表达,加快活性氧自由基的清除,促进DHA等不饱和脂肪酸的积累,增强膜的流动性以适应低温环境。其次,从DHA高产菌株裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512 EST文库筛选出SOD基因,并应用生物信息学分析该氨基酸序列。; 刘静高媛媛江贤章毛若雨田宝玉柯崇榕吴松刚黄建忠; 关键词：裂殖壶菌二十二碳六烯酸

脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶在酿酒酵母中共表达被引量：2: 2010年; 为了利用转基因技术在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中生产二十二碳六烯酸(DHA,22∶6Δ4,7,10,13,16,19n-3),构建了同时含C20-Δ5脂肪酸碳链延长酶(TFD5)和C22-Δ4脂肪酸碳链脱饱和酶(FAD4)基因的共表达质粒pYTFD5-FAD4.该质粒是通过基因重组的方法,使脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶基因置于各自启动子和终止子下获得的.共表达质粒pYTFD5-FAD4转化酿酒酵母所得到基因工程菌,在添加终质量分数为2%的半乳糖,终体积分数为1%的NP-40和0.3 mmol/L的底物二十碳五烯酸(EPA,20∶5Δ5,8,11,14,17n-3)下进行诱导,可直接转化二十碳五烯酸(EPA,20∶5Δ5,8,11,14,17n-3)生成二十二碳五烯酸(DPA,22∶5Δ4,7,10,13,16n-3)和二十二碳六烯酸(DHA,22∶6Δ4,7,10,13,16,19n-3).; 陈晓峰江贤章毛若雨; 关键词：二十二碳六烯酸酿酒酵母共表达

海洋破囊壶菌△^5-延长酶和△^4-脱饱和酶在酿酒酵母中的共表达被引量：2: 2009年; 二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA C22:6n-3)是具有各种重要生理功能的高度不饱和脂肪酸.分别以质粒pYTFD5和pYFAD4为模板,扩增获得860bp的△5-延长酶基因(elo5)和1600bp的△4-脱饱和酶基因(fad4).利用重叠延伸PCR构建elo5-fad4融合基因,Hind Ⅲ/Sph Ⅰ双酶切后连接到经同样处理过的pYES2.0载体,构建重组表达质粒pYELO5-FAD4.转化酿酒酵母尿嘧啶缺陷型菌株INVScl,通过缺少尿嘧啶的选择性培养基筛选阳性克隆子.添加外源脂肪酸C20:5底物,半乳糖诱导表达.气相色谱-质谱分析表明,重组酵母总脂肪酸中出现了DHA(二十二碳六烯酸,C22:6n-3)新产物,融合基因elo5-fad4在酿酒酵母中得到了表达.; 刘艳如江贤章高媛媛田宝玉陈晓峰陈金卿黄建忠; 关键词：破囊壶菌二十二碳六烯酸共表达

Mucor sp.EIM-10 C18-Δ^(15)脂肪酸脱氢酶启动子区域的克隆和功能鉴定被引量：2: 2010年; 应用LA-PCR技术,扩增得到1291bp的Mucor sp.EIM-10Δ15脂肪酸脱氢酶启动子区域的单一产物。对该产物测序,经序列比对分析,发现该序列具有真核启动子序列的基本结构特征,含有TATA盒、CAAT盒、GC盒等元件。根据本中心已构建的质粒PYD15PMCD15和质粒PYGFP,构建启动子功能鉴定阴性质粒PYMCD15,将扩增得到的Δ15脂肪酸脱氢酶启动子区域序列连接到PYMCD15中,构建重组表达质粒PYMD15PMCD15,转化Saccharomyces cerevisiae尿嘧啶营养缺陷型INVSc1。发酵诱导后GC/MS分析,结果表明Δ15脂肪酸脱氢酶启动子区域能够启动Mucor sp.EIM-10Δ15脂肪酸脱氢酶基因的表达。; 毛若雨江贤章陈晓峰田宝玉刘静吴松刚黄建忠; 关键词：MUCOR 脂肪酸脱氢酶 LA PCR 启动子

黑曲霉果胶裂解酶基因在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中的表达被引量：5: 2009年; 利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.; 强慧妮杨欣伟田宝玉柯崇榕林伟铃吕睿瑞黄薇王春香黄建忠; 关键词：黑曲霉果胶裂解酶毕赤酵母

宏基因组学在发现新基因方面的应用被引量：7: 2009年; 现代分子微生物生态学研究表明,自然环境中约99%的微生物不能用传统的分离培养方法获得其纯培养,使得环境微生物中的多样性基因资源难以得到充分的开发和应用。宏基因组学是近年来发展起来的,通过直接提取特定环境中全部微生物的总基因组DNA并克隆到合适的可培养微生物宿主中,来筛选目的基因的方法。它已在微生物新功能基因筛选、活性物质开发和微生物多样性研究等方面取得了显著成果。该文旨在介绍宏基因组学在新功能基因发现方面的应用概况并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最近研究进展进行简要综述。; 强慧妮田宝玉江贤章黄钦耿柯崇榕杨欣伟黄建忠; 关键词：宏基因组学宏基因组文库构建未培养微生物

毛霉△^6-脂肪酸脱氢酶随机突变文库的构建与分析被引量：1: 2011年; 毛霉Mucor sp.EIM-10△6-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径的关键酶。为提高脂肪酸脱氢酶的活性以及研究该酶一级结构对酶活性的影响,利用易错PCR对毛霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(mcd6)进行随机突变,将PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体PYMD6PMCD6连接,获得随机突变质粒PYTBMCD6,转化酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,构建了原始库容为4.6×104 CFU的△6-脂肪酸脱氢酶的随机突变表达文库。随机突变表达文库的构建与分析为定点突变等酶蛋白的理性设计奠定基础。; 宋芬芬江贤章陈清霞黄建忠; 关键词：易错PCR 随机突变毛霉 Γ-亚麻酸

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福建省自然科学基金(2008F3036)