国家自然科学基金(81200727)
- 作品数：13 被引量：30H指数：4
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- 趋化因子CX3CL1和CCL2对人单核细胞来源巨噬细胞的作用及意义被引量：3
- 2014年
- 背景 研究发现巨噬细胞及其分泌的趋化因子与角膜新生血管（CNV）的发生相关.巨噬细胞具有异质性,在不同的微环境以及不同的刺激条件下发挥不同的作用. 目的 检测C-X3-C趋化因子配体1（CX3CL1）和C-C趋化因子配体2（CCL2）对巨噬细胞增生的作用,并探讨其意义. 方法 7～8周龄雄性BALB/c小鼠20只,用角膜碱烧伤的方法构建左眼CNV模型,术后4d在裂隙灯显微镜下检查小鼠CNV情况,颈椎脱臼法处死小鼠并制备角膜切片.用荧光免疫组织化学法检测小鼠角膜组织中巨噬细胞表面两种趋化因子受体C-C趋化因子受体2（CCR2）和CX3CR1的表达.用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,在含质量分数10％胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液中加入30 μg/L粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）,诱导和培养人外周血单核细胞来源的巨噬细胞.将培养的细胞分为CD68＋CCR2组和CD68＋CX3CR1组,分别加入CD68＋CCR2抗体和CD68＋CX3CR1抗体,每组2管,其中一管作为IgG同型对照.采用流式细胞仪分别检测小鼠碱烧伤角膜组织中巨噬细胞和人外周血巨噬细胞中CX3CR1以及CCR2的表达.分别用人重组CX3CL1和CCL2蛋白刺激巨噬细胞,实时定量PCR（real-time PCR）法检测干预后巨噬细胞中血管内皮生长因子（VEGF）、血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶1（ADAMTS-1）、凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）等血管生成相关因子的表达.结果 角膜碱烧伤后4d,裂隙灯显微镜下可见角膜局部有新生血管发生,CNV沿角膜缘向角膜中心区域延伸.荧光免疫组织化学法检测发现,角膜组织内有F4/80阳性的巨噬细胞浸润,其表面可见CCR2和CX3CR1分子的表达,呈绿色荧光.未受GM-CSF诱导培养的巨噬细胞能维持生长约2周,但死亡细胞较多,而经GM-CSF诱导培养的细胞生长稳定,细胞数量增加,无明显悬浮死亡现象.培养的巨噬细胞中CX3CR1表达率平均约为7
- 刘高勤陈磊陈源周文娟张文朋陆培荣
- 关键词：角膜新生血管化学诱导趋化因子巨噬细胞
- 小鼠角膜新生血管内皮细胞的分离培养及其趋化因子受体的表达被引量：4
- 2016年
- 背景研究角膜新生血管生成的病理机制对角膜新生血管的治疗具有重要意义，但目前的相关研究多采用非角膜新生血管来源的血管内皮细胞，研究结果的可靠性受到一定影响。目的探索从碱烧伤诱导实验性小鼠角膜新生血管组织中分离和培养血管内皮细胞的方法，并检测新生血管内皮细胞中趋化因子受体的表达，为角膜新生血管内皮细胞的生物学特性研究奠定基础。方法7—8周龄SPF级健康雄性BALB／c小鼠10只，采用NaOH碱烧伤法构建小鼠实验性角膜新生血管模型，采用免疫荧光技术检测CD31在角膜新生血管中的表达。在碱烧伤后2周摘取眼球分离角膜组织，眼科手术剪剪碎角膜组织后应用胶原酶D消化获取单个细胞，使用包被CD31抗体的磁珠分选获取血管内皮细胞。采用免疫组织化学染色法检测CD31在细胞中的表达以鉴定培养的细胞，采用逆转录PCR法检测血管内皮细胞中趋化因子受体基因的表达。结果碱烧伤后7d裂隙灯显微镜下可见小鼠左眼角膜出现新生血管，碱烧伤后2周角膜新生血管的形成达高峰，免疫荧光检测可见角膜组织内特异性CD31染色的血管网。角膜新生血管血管内皮细胞培养后2h贴壁生长，形态呈扁平多边形，体积较大，传代培养后细胞生长速度明显加快。培养的角膜新生血管内皮细胞CD31表达阳性，细胞质中呈棕黄色染色，而角膜基质细胞中CD31表达阴性。逆转录PCR结果显示分离培养的血管内皮细胞中CCR1、CCR2、CCR3和CCR4mRNA相对表达量最高，CXCR3、CCR6、CCR10和CX3CRlmRNA呈中等强度表达，CCR5、CCR8mRNA相对表达量较低，而CCR9、CXCR4和CXCR5mRNA表达未检测到。结论CD31抗体的磁珠分选法可有效分离纯化小鼠角膜新生血管内皮细胞，并可进行体外培养且培养的细胞可表达趋化因子受体。
- 刘高勤肖艳辉陈志刚徐静陆培荣
- 关键词：趋化因子受体
- 热休克蛋白B6中和性抗体对脉络膜血管内皮细胞管腔形成的影响及其机制
- 2013年
- 背景血管内皮细胞的增生和迁移是血管发生的主要环节。新近的研究发现，热休克蛋白B6（HspB6）可促进多种与血管新生相关因子的分泌，导致病理状态下新生血管的发生，研究HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞增生、迁移和管腔形成能力的影响对于脉络膜新生血管相关疾病的靶向治疗具有重要意义。目的探讨HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞管腔形成能力的影响及其机制。方法对人脉络膜血管内皮细胞株进行培养和传代，取对数生长期细胞用于实验。应用逆转录PCR（RT—PCR）和流式细胞术检测HspB6mRNA及其蛋白在人脉络膜血管内皮细胞中的表达。将基质胶铺于96孔板中，凝固后加入细胞悬液，细胞密度为2×10^4个／孔，将不同质量浓度（100μg／L、500μg／L）HspB6中和性抗体分别加入培养孔，未加入HspB6中和性抗体的细胞作为对照组（0μg／LHspB6中和性抗体组），每组设3个复孔。细胞孵育12h后，采用体外三维成型法检测各组完整管腔形成的数量，以评价HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞的管腔形成能力。96孔板培养人脉络膜血管内皮细胞，培养液中加入不同质量浓度（0、50、100、500μg/L）HspB6中和性抗体孵育24h，然后采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞的增生值。采用Transwell小室法检测HspB6中和性抗体作用24h后各组穿过小室膜的“贴壁”细胞数目，以评估人脉络膜内皮细胞的增生和迁移情况。收集HspB6中和性抗体干预后的人脉络膜血管内皮细胞，流式细胞术检测HspB6中和性抗体作用后各组人脉络膜血管内皮细胞的凋亡率。结果人脉络膜血管内皮细胞在基因和蛋白水平均可表达HspB6分子。0、100、500μg／LHspB6中和性抗体组管腔形成数目分别为（67．25±5．75）、（60．39±6．41）和（39．76±10．73）个／视野，总体比较差异有�
- 陈惠康张济明李龙标钱益勇刘高勤罗宝根费梅
- 关键词：热休克蛋白中和性抗体新生血管迁移凋亡
- 趋化因子受体CCR3拮抗剂在实验性角膜新生血管发生过程中的作用和机制被引量：1
- 2014年
- 目的 探讨趋化因子受体CCR3拮抗剂在实验性角膜新生血管发生过程中的作用及机制.方法 实验研究.以碱烧伤法诱导实验性小鼠角膜新生血管模型;选用动物为54只7～8周龄雄性健康的BABL/c小鼠,随机数字表法分成对照组、实验组及VEGF抗体阳性对照组,每组18只;Real-time PCR法检测CCR3在碱烧伤角膜组织中的动态表达;烧伤后角膜局部应用CCR拮抗剂进行干预,在碱烧伤后2周大体观察及全角膜铺片CD31组织化学染色法检测角膜新生血管发生情况;Real-time PCR和免疫印迹法检测烧伤角膜组织内血管生成相关因子的表达.应用独立样本t检验法比较各组间差异.结果 碱烧伤后2周,CCR3拮抗剂干预组角膜新生血管相对值较对照组明显减少.对照组为0.77 ±0.15,实验组为0.51 ±0.03,差异有统计学意义（t=12.91,P =0.00）.免疫印迹检测结果显示角膜组织内VEGF的表达对照组为1.15 ±0.30,实验组为0.91 ±0.24,差异无统计学意义（t=1.08,P =0.34）.结论 CCR3信号通路阻滞后能抑制实验性角膜新生血管的发生.
- 刘高勤赫雪飞周文娟肖艳辉陈志刚陆培荣
- 关键词：角膜新生血管化眼烧伤
- 一氧化氮合成酶及其抑制剂在碱烧伤诱导的角膜新生血管中的作用被引量：6
- 2013年
- 背景 研究发现一氧化氮（NO）及一氧化氮合成酶（NOS）参与新生血管的发生、发展,但其在角膜新生血管（CNV）发生过程中的具体作用机制是眼科界值得关注的问题. 目的 研究NOS及其抑制剂NW-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）在实验性CNV发生过程中的作用,并通过体外研究验证NOS及L-NAME对人血管内皮细胞（RECs）血管管腔形成的作用,为眼科新生血管性疾病的防治提供实验依据.方法7～8周龄雄性BALB/c小鼠36只用NaOH滤纸贴附角膜中央的方法构建小鼠左眼CNV模型,然后用随机数字表法将小鼠分为L-NAME干预组和PBS对照组,L-NAME干预组小鼠于造模前1周开始腹腔内注射10 g/LL-NAME 0.5 ml,每周3次,持续3周,而PBS对照组小鼠以同样的方法注射PBS.分别于造模后2、4、7、14 d在裂隙灯显微镜下观察CNV形成情况,用全角膜铺片法检测CD31在CNV中的表达以鉴定CNV面积；采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测2个组小鼠角膜组织中NOSmRNA的表达；采用Western blot法检测人RECs中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达；利用体外实验,观察人RECs的管腔形成能力.采用独立样本t检验对2个组小鼠上述各检测指标的结果进行差异比较,分类资料采用X2检验. 结果裂隙灯显微镜下可见小鼠造模后2周CNV生长达高峰,而L-NAME干预组小鼠CNV明显少于PBS对照组.造模后2、4、7 d,L-NAME干预组小鼠角膜中NOS mRNA的相对表达量均明显低于PBS对照组,差异均有统计学意义（t=19.481、22.059、10.961,P＜0.01）.全角膜铺片法检测显示,L-NAME干预组被CD31标记的RECs面积与总面积的比值为0.59 ±0.01,明显小于PBS对照组的0.78±0.10,差异有统计学意义（t=3.078,P＜0.05）.Western blot法检测表明,造模0、2、4、7d,L-NAME干预组人RECs中VEGF蛋白的相对表达量均明显降低,造模后4d、7d两组比较差异均有统计学意义（-7.696、17.953,P＜0.01）.管腔形成实验中,L-NAM
- 刘高勤陈源陈磊肖艳辉陈志刚陆培荣
- 关键词：角膜新生血管一氧化氮合成酶血管内皮生长因子碱烧伤
- 白细胞介素17在人视网膜血管内皮细胞增生、迁移及凋亡中的作用
- 2015年
- 目的 观察白细胞介素17（IL-17）在人视网膜血管内皮细胞（HREC）增生、迁移及凋亡中的作用.方法 体外培养HREC,并取对数生长期的细胞进行实验.采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测HREC中IL-17受体（IL-17R）基因和蛋白的表达.以不含IL-17的培养液培养细胞作为对照组.以浓度50、100、200、500 μg/L的1L-17培养液干预HREC,采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）增生分析法检测不同浓度IL-17对HREC细胞增生的作用,细胞划痕法测定不同浓度IL-17对HREC细胞迁移的影响.以浓度200 μg/L的IL-17培养液干预HREC,采用流式细胞技术检测1L-17对HREC细胞凋亡的影响.以1、2 mg/L的IL-17培养液干预HREC,应用RT-PCR检测HREC中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase3）、凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）的mRNA表达,Western blot检测细胞中Caspase-3的蛋白表达.结果 HREC中存在IL-17R的基因和蛋白表达.CCK-8增生分析法结果显示,随着IL-17培养液的浓度不断增加,吸光度[A,旧称光密度（OD）]值也呈上升趋势.与对照组比较,200、500 μg/L干预组A值明显升高,差异均有统计学意义（t=-3.235、-6.276,P=0.032、0.000）.细胞划痕法检测结果显示,干预12、24 h时,100 μg/L干预组（t=-3.551、-2.849,P=0.006、0.019）、200μg/L干预组（t=-10.347、-4.519,P=0.000、0.001）、500 μg/L干预组（t=-3.541、-2.607,P=0.008、0.036）HREC迁移距离均明显增加,差异有统计学意义.流式细胞技术检查结果显示,200 μg/L干预组细胞凋亡比例较对照组明显下调,差异有统计学意义（t=5.682,P=0.047）.RT-PCR及琼脂糖电泳结果显示,经IL-17干预后HREC中bFGF的mRNA表达水平呈升高趋势,而Caspase-3和TSP-1的mRNA表达水平呈下调趋势.Western blot检测结果显示,经IL-17干预后HREC中Caspase-3蛋白表达呈下调趋势.结论 IL-17能促进HREC增生、迁移,并�
- 徐静刘高勤陈志刚陆培荣
- 关键词：白细胞介素17细胞运动
- 局部应用地塞米松对翼状胬肉组织中趋化因子受体CCR3表达的影响及意义被引量：1
- 2014年
- 目的探讨术前局部应用地塞米松对趋化因子受体CCR3在翼状胬肉中表达的影响和意义。方法选取30例翼状胬肉患者,分为用药组和对照组,术前2周分别局部滴用3 g·L-1妥布霉素地塞米松眼液或3 g·L-1妥布霉素眼液,取手术切除的翼状胬肉组织;RT-PCR及Western blot法检测趋化因子受体CCR3 mRNA水平及蛋白水平的表达,进一步采用免疫组织化学法检测其蛋白水平的表达。结果翼状胬肉组织中CCR3在mRNA和蛋白水平均存在表达,但用药组CCR3 mRNA表达明显低于对照组,差异有统计学意义(t=-5.713,P=0.013),用药组CCR3的蛋白表达也明显低于对照组(t=-3.915,P=0.001)。免疫组织化学染色显示CCR3表达主要分布在结膜上皮细胞及部分血管内皮细胞上。结论趋化因子受体CCR3可能参与翼状胬肉的发生发展。地塞米松引起的CCR3表达改变是影响翼状胬肉预后、减少术后复发的可能机制之一。
- 赫雪飞刘高勤陈志刚陆培荣
- 关键词：翼状胬肉趋化因子趋化因子受体
- 人热休克蛋白B6的真核蛋白表达与生物学功能
- 2014年
- 目的构建人热休克蛋白B6(HspB6)重组表达载体,初步研究其生物学活性。方法采用RT-PCR法扩增HspB6CDS段序列,并将扩增产物与小鼠Fc片段融合成重组基因HspB6/mFc,测序正确后插入蛋白表达载体pCEP4,随后转染人肾上皮293T细胞。扩增培养后收集细胞上清液用于浓缩、纯化以及Western blot验证。采用CCK-8法和Transwell实验分别检测HspB6/mFc融合蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移的影响。结果成功构建pCEP4/HspB6/mFc重组载体,并获得稳定表达HspB6/mFc融合蛋白的293T细胞。HspB6/mFc融合蛋白能明显促进HUVEC增殖和迁移。结论 pCEP4/HspB6/mFc重组载体及稳定表达的HspB6/mFc融合蛋白为进一步研究HspB6的生物学功能提供物质基础。
- 陈惠康陆培荣张济明钱益勇刘高勤罗宝根费梅
- 关键词：真核表达融合蛋白
- ADP-核糖基化因子抑制剂在实验性碱烧伤诱导角膜新生血管中的作用及其机制被引量：2
- 2014年
- 背景角膜新生血管（CNV）是导致角膜盲的主要原因之一，研究表明，ADP一核糖基化因子（ARF）对肿瘤细胞的增生有调节作用，抑制ARF能抑制血管的形成，但ARF抑制剂对CNV是否发挥作用尚不清楚。目的探讨ARF抑制剂在碱烧伤诱导的CNV形成过程中的作用及其机制。方法7～8周龄清洁级雄性BABL／c小鼠60只按照随机数字表法分为PBS对照组和ARF抑制剂干预组，每组各30只。所有小鼠采用角膜碱烧伤诱导法构建CNV模型，ARF抑制剂干预组小鼠于造模后1周腹腔内注射0．5g／LARF抑制剂溶液0．5ml，每周3次，共1周，PBS对照组小鼠以同样方式注射0．5mlPBS。各组分别取24只小鼠，于造模后0、4、7、14d采用实时定量PCR（real—timePCR）和Westernblot法检测小鼠角膜组织中ARFmRNA和蛋白的动态表达，并于造模后14d，采用Westernblot法检测各组小鼠角膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达。各组另取6只小鼠，于造模后2、4、7、14d裂隙灯显微镜下观察CNV形成情况，并于造模后14d，采用全视网膜铺片免疫荧光组织化学法检测角膜组织中CD31在CNV中的表达。体外实验中应用ARF抑制剂干预人视网膜血管内皮细胞（RECs），CCK8法和细胞划痕法检测ARF对人RECs增生和迁移的影响。实验动物的使用和喂养遵循视觉及眼科学研究协会有关规定及苏州大学《实验动物管理及使用指南》。结果造模后PBS对照组和ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织中ARFmRNA在各个时间点均有表达，在造模后14d达高峰，各组小鼠角膜中ARFmRNA的表达随着时间的延长而增加，差异有统计学意义（F时间=65．17，P=0．00），不同时间点的组间比较差异无统计学意义（F＊＊=1．98，P=0．18）；造模后14d，ARF抑制剂干预组实验后不同时间点ARF蛋白水平相对表达值比较差异有统计学意义（F=10．77，P=0．00）。裂隙灯显微镜下检查发现�
- 刘高勤吴敬陈志刚肖艳辉陆培荣
- 关键词：角膜新生血管碱烧伤血管内皮生长因子血管内皮细胞
- ADP-核糖基化因子拮抗剂对人视网膜血管内皮细胞形成血管管腔的抑制作用及其机制被引量：2
- 2016年
- 背景研究证实ADP-核糖基化因子（ARF）能促进角膜组织中促血管相关因子的分泌，如血管内皮生长因子（VEGF）和一氧化氮合酶（NOS）等，从而导致病理状态下角膜新生血管的发生，但ARF对人视网膜膜血管内皮细胞（HRECs）管腔形成能力的影响和机制尚不清楚，了解ARF对HRECs形成管腔能力的影响对研究视网膜新生血管相关疾病的靶向治疗具有重要意义。
目的探讨ARF拮抗剂对HRECs管腔形成能力的影响以及其作用机制。
方法对HRECs进行常规培养和传代，取对数生长期细胞分为对照组和ARF拮抗剂组，对照组细胞在实验过程中按常规培养法培养，培养基中不添加ARF拮抗剂，而ARF拮抗剂组细胞在后续实验时于培养液中添加15 μmol/L的ARF拮抗剂1 ml。采用逆转录PCR法和Western blot法检测ARF mRNA及蛋白在HRECs中的表达。应用半固态Matrigel胶体外三维成型法检测对照组和ARF拮抗剂组HRECs形成管腔形态和数目。采用RT-PCR和Western blot法检测VEGF、NOS、局部黏着斑激酶（FAK）、热休克蛋白90（HSP90）mRNA及蛋白在各组HRECs中的相对表达量。
结果逆转录PCR和Western blot法检测显示，对照组和ARF拮抗剂组HRECs中ARF mRNA的相对表达量分别为0.65±0.14和0.32±0.10，对照组和ARF拮抗剂组HRECs中ARF蛋白的相对表达量分别为0.85±0.15和0.24±0.17，ARF拮抗剂组ARF mRNA及其蛋白的相对表达量均明显低于对照组，差异均有统计学意义（t＝7.32，P＝0.00；t＝5.15，P＝0.00）。对照组和ARF拮抗剂组HRECs形成管腔的数量分别为（51.46±7.12）和（34.66±8.57）个/视野，差异有统计学意义（t＝2.99，P＝0.04）。RT-PCR和Western blot法检测显示，ARF拮抗剂组HRECs中VEGF mRNA和NOS mRNA及蛋白的相对表达量均明显低于对照组，差异均有统计学意义（t＝3.02，P＝0.04；t＝3.68，P＝0.02；t＝3.33，P＝0.03；t＝2.89，P＝0.04）。ARF拮抗剂组HREC
- 吴敬刘高勤陈志刚肖艳辉徐静陆培荣
- 关键词：视网膜
